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目的:观察六味地黄方对绝经后动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）中雌激素受体（Estrogen receptor,ER）表达及其DNA甲基化的影响,找到六味地黄方调控的关键甲基化位点。同时,探讨六味地黄方是否通过DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）和去甲基化酶（Ten-eleven translocations,TETs）调节ER表达,从而发挥抗平滑肌细胞增殖和绝经后AS的作用。方法:首先,我们从临床收集了绝经前后女性的主动脉血管,通过HE染色和透射电镜观察血管的病变程度。随后,利用LDLR-/-小鼠通过高脂喂养合并双侧去卵巢手术复制绝经后AS小鼠模型,并用六味地黄方干预治疗90天。实验周期结束后,通过生化试剂盒观察小鼠血脂四项水平;通过油红和Masson染色观察小鼠主动脉的病变程度;通过免疫组织荧光观察小鼠主动脉根部平滑肌的增殖情况;通过ELISA试剂盒观察小鼠血清血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）和同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）水平。在细胞层面上,我们利用Hcy诱导人血管平滑肌细胞（Human vascular smooth muscle cells,HVSMCs）增殖模型,并用六味地黄方进行干预。通过MTT观察不同时间和不同浓度的Hcy对HVSMCs细胞活力的影响;通过MTT、细胞划痕、Transwell和流式细胞术观察六味地黄方对HVSMCs增殖、迁移和细胞周期的影响;通过细胞免疫荧光染色观察六味地黄方对HVSMCs表型转换的影响。通过该部分实验揭示六味地黄方抗绝经后AS和抑制HVSMCs增殖的作用。通过免疫组织化学染色观察绝经后女性和绝经后AS小鼠主动脉中ERs的表达;通过WB和PCR观察六味地黄方对HVSMCs中ERs表达的影响;通过MethylTarget甲基化测序,观察绝经后AS女性主动脉和HVSMCs增殖模型中ESR1（编码ERα蛋白的基因）各片段的DNA甲基化率,同时观察六味地黄方对ESR1甲基化率的影响。通过该部分实验揭示六味地黄方对绝经后AS中ERs表达及其DNA甲基化的影响。通过免疫组织化学染色观察绝经后女性和绝经后AS小鼠主动脉中DNMTs和TETs的表达;通过ELISA试剂盒观察小鼠血清DNMTs和TETs水平;通过甲基化试剂盒观察六味地黄方对绝经后AS小鼠血液和HVSMCs整体甲基化的影响:通过WB和PCR观察六味地黄方对HVSMCs中DNMTs和TETs表达的影响。通过该部分实验揭示六味地黄方对绝经后AS中DNMTs和TETs表达的影响。根据上一步的结果,我们通过转染DNMT3a过表达质粒和TET2 siRNA,构建了 DNMT3a高表达和TET2低表达的HVSMCs细胞模型。在此基础上,再用Hcy和六味地黄方进行干预,通过WB验证DNMT3a和TET2的表达;通过细胞划痕、Transwell和流式细胞术观察六味地黄方对HVSMCs增殖、迁移和细胞周期的影响;通过细胞免疫荧光染色观察六味地黄方对HVSMCs表型转换的影响;通过甲基化试剂盒观察六味地黄方对HVSMCs整体甲基化的影响;通过WB和PCR观察六味地黄方对ERα表达的影响。通过该部分实验证实六味地黄方是否通过调节DNMT3a和TET2来影响ERα的表达。最后,利用dCas9-DNMT3a靶向高甲基化ESR1,通过WB和PCR观察六味地黄方对ERα表达的影响;通过细胞划痕、Transwell和流式细胞术观察六味地黄方对HVSMCs增殖、迁移和细胞周期的影响;通过细胞免疫荧光染色观察六味地黄方对HVSMCs表型转换的影响。通过免疫共沉淀实验观察ERα、TET2和DNMT3a之间的结合作用。通过该部分实验证实六味地黄方通过降低ESR1的DNA甲基化,上调ERα表达,从而抗HVSMCs增殖。结果:在第一章中,我们发现与绝经前AS女性相比,绝经后AS女性主动脉内皮层细胞凋亡增加,平滑肌层细胞显著增殖。绝经后AS小鼠的血脂TC、TG和LDL-c的水平显著升高,主动脉脂质沉积增加,证实绝经后AS模型复制成功。六味地黄方（9.0 g/kg）的干预能够显著降低绝经后AS小鼠血液中TC、TG和LDL-c的水平,升高HDL-c的水平,减少主动脉的脂质沉积,减缓了 AS的病变。绝经后AS小鼠血管中平滑肌明显增殖,血液中AngⅡ和Hcy的水平显著升高。六味地黄方能显著抑制绝经后AS小鼠主动脉根部平滑肌细胞的增殖,并降低了血液中AngⅡ和Hcy的水平。250 μM的Hcy干预24小时可以诱导HVSMCs达到60%的增殖率,而12 μg/mL的六味地黄方可以显著抑制HVSMCs的增殖。Hcy诱导HVSMCs发生了明显的增殖和迁移,G0/G1期细胞显著减少,S期和G2/M期细胞增多。六味地黄方可以显著抑制Hcy引起的HVSMCs增殖和迁移,同时显著增加处于G0/G1期的细胞,减少处于S期和G2/M期的细胞。在Hcy诱导的HVSMCs中,收缩型蛋白α-SMA表达显著降低,而合成型蛋白OPN的表达显著升高。六味地黄方的干预能够显著上调α-SMA,下调OPN,抑制了平滑肌细胞的表型转换。在第二章中,我们发现绝经前AS女性血管内皮和平滑肌层中均以ERα表达为主,绝经后ERα、ERβ和GPR30的表达均明显降低。在绝经后AS小鼠主动脉根部ERs表达显著下降,六味地黄方的治疗显著上调了 ERs的表达。在Hcy诱导的HVSMCs增殖模型中,仅ERα表达显著下降,六味地黄方的干预也显著上调了 ERα的表达。测序结果表明在绝经后AS女性主动脉和Hcy诱导的HVSMCs增殖模型中,ESR1的甲基化率均明显升高,且六味地黄方能降低HVSMCs增殖模型中ESR1的甲基化率。在第三章中,绝经后AS女性内皮层DNMT1显著上升,而DNMT3a和DNMT3b则无显著变化;平滑肌层的DNMT1和DNMT3a表达显著增加,而DNMT3b则无显著变化。绝经后AS小鼠血液5-mc的含量显著升高,5-hmc的含量显著降低,整体甲基化水平增加。六味地黄方降低了绝经后AS小鼠血液中5-mc的含量,升高了 5-hmc的含量,降低了整体甲基化水平。在绝经后AS小鼠血液中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达均显著升高,而在血管中仅DNMT1和DNMT3a显著升高。六味地黄方的干预则可明显抑制血液和血管中DNMTs的升高。Hcy引起了 HVSMCs中整体甲基化的降低,六味地黄方的干预显著上调了细胞中5-mc的含量。在Hcy诱导的HVSMCs增殖模型中,DNMT1表达显著降低,DNMT3a和DNMT3b表达显著上调。六味地黄方的干预显著上调了细胞中DNMT1的表达,但是显著下调了 DNMT3a和DNMT3b的表达。同时,我们发现与绝经前AS女性相比,绝经后AS女性血管内皮层和平滑肌层的TET1、TET2和TET3的表达均显著增加。绝经后AS小鼠血液和血管中TET1、TET2和TET3的表达均显著升高,六味地黄方的干预能显著降低TETs的表达。Hcy显著升高了 HVSMCs中TET1的表达,抑制了 TET2的表达,但对TET3的表达无显著影响,而六味地黄方的干预能够显著下调了 TET1的表达,上调了 TET2的表达。在第四章和第五章中,我们转染了 DNMT3a过表达质粒和TET2 siRNA,DNMT3a表达显著升高,TET2的表达显著降低,证实了染转的成功。在DNMT3a高表达和TET2低表达后,HVSMCs显著增殖和迁移,G0/G1期的细胞减少,S期和G2/M期的细胞增多;收缩表型蛋白α-SMA表达显著降低,合成表型蛋白OPN表达显著升高;整体甲基化水平升高;且ERα表达显著降低。与转染前相比,六味地黄方在DNMT3a高表达和TET2低表达后抑制HVSMCs增殖、迁移和表型转换的作用都被减弱,同时上调ERα表达的作用也被减弱。该结果证实六味地黄方通过降低DNMT3a,上调TET2,从而调节ERα的表达。ESR1共有23个CpG岛,其中片段5、片段10和片段21位于启动子前和外显子上。在第六章中,我们定向高甲基化了这三个片段,发现甲基化片段5抑制ERα表达的作用最显著,且六味地黄方能显著降低该片段的甲基化率。在定向高甲基化片段5后,HVSMCs显著增殖和迁移,G0/G1期的细胞减少,S期和G2/M期的细胞增多,收缩表型蛋白α-SMA表达显著降低,合成表型蛋白OPN表达显著升高。与未定向高甲基化组相比,高甲基化片段5后,六味地黄方抑制HVSMCs增殖、迁移和表型转换的作用也被减弱。该结果证实六味地黄方通过抑制ESR1的甲基化,上调ERα表达,从而抗HVSMCs的增殖。此外,免疫共沉淀结果揭示ERα、TET2和DNMT3a三者之间彼此互相结合,形成了蛋白复合物。结论:1.六味地黄方能够显著改善绝经后AS主动脉的病变,减少脂质沉积,抑制平滑肌细胞的增殖。2.绝经后AS中ERα表达显著降低,ESR1的DNA甲基化率显著升高,其中CpG岛片段5的甲基化抑制ERα表达的作用最为显著。六味地黄方能够通过降低ESR1的甲基化率,升高ERα表达,从而抑制HVSMCs增殖。3.绝经后AS中DNMT1和DNMT3a的表达显著升高,而在Hcy诱导的HVSMCs中,DNMT1的表达显著降低,DNMT3a和DNMT3b的表达显著升高。六味地黄方能够显著降低绝经后AS小鼠中DNMT1和DNMT3a的表达,且六味地黄方能够通过降低DNMT3a上调ERα表达,从而抑制HVSMCs的增殖。4.绝经后AS中TET1、TET2和TET3的表达均显著升高,而在Hcy诱导的HVSMCs中,TET1的表达显著升高,TET2的表达显著降低,TET3的表达无显著变化。六味地黄方能够显著降低绝经后AS小鼠中TETs的表达,且六味地黄方能够通过升高TET2上调ERα表达,从而抑制HVSMCs的增殖。5.ERα、TET2和DNMT3a三者之间彼此互相结合,形成了蛋白复合物。