【摘 要】
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目的结直肠癌（colorectal cancer,CRC）为全球第三大恶性肿瘤,中晚期结直肠癌患者治疗效果不佳。因此深入研究结直肠癌发生发展的分子机制,有助于寻找其治疗靶点及改善患者预后。miRNA是小的单链非编码RNA,主要通过与3’非翻译区的互补序列结合而与mRNA相互作用,从而发挥基因负性调控的作用。miR-452-5p已被报道在多种肿瘤的发生发展中起重要作用,但其在结直肠癌中的研究较少。本
【基金项目】
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广东省科技计划项目（2017B020209003）； 广东省科技计划项目（2017B030314037）； 国家科技重大专项基金资助项目（2020ZX09201017）；
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目的结直肠癌（colorectal cancer,CRC）为全球第三大恶性肿瘤,中晚期结直肠癌患者治疗效果不佳。因此深入研究结直肠癌发生发展的分子机制,有助于寻找其治疗靶点及改善患者预后。miRNA是小的单链非编码RNA,主要通过与3’非翻译区的互补序列结合而与mRNA相互作用,从而发挥基因负性调控的作用。miR-452-5p已被报道在多种肿瘤的发生发展中起重要作用,但其在结直肠癌中的研究较少。本研究旨在研究miR-452-5p在结直肠癌中的表达情况,探索miR-452-5p是否能够影响结直肠癌细胞的生物学功能及其发挥作用的具体分子机制。方法1.miR-452-5p在结直肠组织及细胞系中的表达验证1)公共数据库TCGA分析明确miR-452-5p在结直肠癌组织及正常肠上皮组织中的表达情况;2)qRT-PCR实验检测miR-452-5p在结直肠癌组织及配对正常组织、结直肠癌细胞系及正常肠上皮细胞系中的表达水平。2.miR-452-5p促进结直肠癌细胞恶性生物学行为1)体外增殖:将miR-452-5p mimics和inhibitors瞬时转染至结直肠癌细胞中,验证效率后进行CCK8实验及平板克隆实验;2)细胞周期:通过细胞周期实验验证miR-452-5p对结直肠癌细胞周期的影响;3)化疗抵抗:通过IC50、细胞凋亡实验及western Blot实验验证miR-452-5p对结直肠癌细胞凋亡以及对5-氟尿嘧啶化疗抵抗的影响;4)体内增殖:miR-452-5p过表达慢病毒感染结直肠癌细胞进行裸鼠皮下成瘤实验。3.miR-452-5p—PKN2/DUSP6—c-Jun 正反馈环路机制验证1)将测序结果中表达下调基因与预测靶基因数据库交集明确靶基因,并通过qRT-PCR、western Blot、双荧光素酶报告基因实验进行验证;2)通过western blot实验明确miR-452-5p对ERK/MAPK信号通路的作用;3)通过恢复实验（CCK8实验、平板克隆实验）验证PKN2/DUSP6轴参与miR-452-5p调控结直肠癌的过程。4)通过生物信息学分析预测、qRT-PCR及染色质免疫共沉淀实验证实了c-Jun对miR-452-5p的转录调控作用。结果1.与正常组织比较,结直肠癌组织中miR-452-5p的表达水平明显上调;并且在恶性程度较高的肿瘤细胞系HT29细胞中表达较高,在恶性程度较低的细胞系RKO、SW480中表达水平较低,且FHC中表达水平最低。2.miR-452-5p过表达后体外及体内增殖能力增强,且促进结直肠癌细胞G1/S期转化。3.miR-452-5p过表达的细胞5-氟尿嘧啶IC50值升高,凋亡率下降,5-氟尿嘧啶处理细胞后凋亡率趋势与之相同,提示miR-452-5p可以降低凋亡并且增强结直肠肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的化疗抵抗作用。4.miR-452-5p直接靶向PKN2、DUSP6,促进ERK/MAPK信号通路的异常激活。5.恢复性实验证明,PKN2、DUSP6过表达可抵消miR-452-5p对结直肠癌恶性生物学行为的促进作用。6.c-Jun对miR-452-5p的表达水平起转录调控作用。结论本研究证实miR-452-5p在结直肠癌中表达上调,过表达miR-452-5p可通过靶向PKN2/DUSP6轴来激活ERK/MAPK信号通路,miR-452-5p—PKN2/DUSP6—c-Jun正反馈环路机制促进结直肠癌的恶性生物学行为。
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