肺癌是目前全球范围内最常见的恶性肿瘤,近20多年的追踪发现,每年的肺癌新病例以大约0.5%的速率在增长,其死亡率位居恶性肿瘤之首,严重危害人类的生命及健康。卫生部第三次全国死因调查显示,肺癌为我国首位恶性肿瘤死亡的原因。其中非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)是指除了小细胞癌以外的所有类型的肺癌,占所有肺癌的75%-80%。此类肺癌的治疗多采用以手术治疗为主的治疗方法。由于早期临床症状多数不甚明显,70%以上的病人在就诊时已经处于临床晚期,而且多发生了淋巴结或其他脏器的转移,往往已经失去了手术的机会。尽管随着诊疗水平的不断提高,非小细胞肺癌的生存有所改善,但总的来说预后仍然很差,中位生存期不到一年。非小细胞肺癌的一线化疗有效率约为20%-35%,二线化疗的有效率通常小于10%。用于非小细胞肺癌的多种治疗方案最多使中位生存期延长2-4个月。随着免疫学及分子生物学的进展和对肿瘤发病机制的深入研究,肿瘤治疗进入了分子靶向治疗时代。新一代分子靶向药物蛋白酶体抑制剂Bortezomib(硼替佐米,商品名：万珂)已分别于2003年和2005年由美国FDA批准用于多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的治疗,通过抑制泛素蛋白酶体通路中NF-κB的活性发挥抗肿瘤作用。但是,Bortezomib在肺癌中的作用机制目前国内还鲜见文献报道。本实验通过研究Bortezomib对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的增殖、凋亡、细胞周期及核转录因子(NF-κB)活性的影响,探讨其在肺癌中的抗肿瘤机制。材料与方法1材料来源Bortezomib购自西安杨森生物制药有限公司。抗小鼠NF-κB、抗兔IκBα、抗山羊Bcl-2、抗兔β-Tublin和抗兔β-Actin的一抗购自美国Santa Cruz公司。抗鼠、抗山羊和抗兔的辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥生物有限公司。GLC82、95D、H520、A549、973、H1299 6个NSCLC细胞系均由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所提供。Western blot中提取细胞总蛋白的细胞裂解液由本实验室提供。提取细胞核浆蛋白的试剂盒NE-PER Nuclear and Cytoplastic Extraction Reagents购自美国Pierce公司。2试验方-法(1)MTT法检测Bortezomib对细胞生长的抑制作用细胞分4组：对照组(以无Bortezomib处理的正常培养细胞),25nmol/L组、50nmol/L组、100nmol/L组,分别采用25、50、1 OOnmol/LBortezomib作用48小时,MTT法测定细胞的生长抑制情况。(2)流式细胞仪检测Bortezomib对细胞周期和凋亡的影响取95D、973、GLC82细胞,均设为2组：25nmol/L组(采用25nmol/LBortezomib作用48h)和对照组(以无Bortezomib处理的正常培养细胞)。流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况。(3)用Western blot检测不同浓度的Bortezomib作用不同时间对NSCLC细胞系中NF-κB的基本表达及活性的影响,同时检测Bortezomib处理前后NSCLC中Bcl-2的表达情况。3结果(1)不同浓度Bortezomib对非小细胞肺癌生长的抑制作用Bortezomib对肺癌细胞的生长抑制作用具有剂量依赖性,随浓度的增加抑制作用增强。(2)Bortezomib对细胞周期和凋亡的影响25nmol/L的Bortezomib作用48小时(h)使NSCLC细胞系的细胞周期阻滞在了G2/M期,且处理后的处于G2/M期的细胞比例高于处理前,P<0.05。(3)Bortezomib对NF-κB表达的影响Western blot结果显示Bortezomib对组成性的NF-κB的表达水平没有影响,但是能明显地抑制TNF-α诱导的NF-κB的核转位,并且这种抑制作用具有剂量依赖性。(4)Bortezomib对973细胞中Bcl-2表达的影响作为973的对照细胞中存在抗凋亡基因Bcl-2的表达。将细胞暴露于不同浓度的Bortezomib中处理后,可见Bcl-2的表达水平随Bortezomib作用浓度的增加而降低。4结论Bortezomib能够抑制非小细胞肺癌细胞系发生增殖,并使细胞发生G2/M期的阻滞,诱导细胞发生凋亡,同时抑制NF-κB的诱导性活化,下调细胞中Bcl-2的表达。