多杀性巴氏杆菌是重要的畜禽病原菌,可以引起猪肺疫、牛出败、禽霍乱等,给畜牧业造成重大损失;同时它也是人类的机会性致病菌,能够引起人类呼吸道的多种感染或继发感染。研究表明,PM的外膜蛋白尤其是那些只在体内特殊条件下才表达的膜蛋白是免疫识别的主要抗原,在预防疾病中发挥重要作用。　　 本实验选择可调控启动子的跨膜输出蛋白选择克隆载体pMB-Ara-T,克隆多杀性巴氏杆菌C48-19的跨膜输出蛋白基因。我们以引物30N8和多杀性巴氏杆菌C48-19基因组DNA为模板的混合物用Klenow延伸,将上述反应混合物作为PCR反应的模板,以OL30作为引物,进行rPCR扩增,扩增出的rPCR产物大小集中在200bp～2000bp。将质粒pMB-Ara-T经XcmI酶切纯化后与纯化后的rPCR产物连接,连接产物纯化后电转化到感受态TG1,37℃水浴后加甘油至10％,-20℃保存。从1ml转化液中取20ul涂布于Kan抗性平板,长出300-400个克隆,估算十次转化后组成了含有2.0×105个克隆的基因组文库,菌落PCR检测显示文库插入率在95％以上,片段大小集中在250bp-500bp之间。　　 将甘油保存的文库经Amp+Kan+1.0％arabinose筛选共获得333个克隆子,333个克隆再经过Amp+Kan平板筛选得到31个克隆。序列测定、BLAST分析表明其中333个基因高度同源于多杀性巴氏杆菌Pm70中的258个基因;ORF分析、Singal P预测等结果表明,333个克隆子都含有信号肽结构,片段以阅读框对位的方式插入,插入片段基因和报告基因(△P△SP Amp)融合表达;启动子预测分析表明258个基因中有140个含有完整的启动子序列结构,除去自主表达的31个克隆编码的29个基因,确定剩下的111个基因的启动子为LB培养条件下沉默的启动子,只在特殊诱导条件下才开放:通过对基因跨膜螺旋结构的预测和分析,有178个克隆含有一个或一个以上的跨膜螺旋结构,编码了134种基因,其余的106个克隆子一共编码了78种需要特殊诱导表达的膜蛋白基因,其中79个含有完整的启动子序列结构,其中69种需要特殊诱导表达。　　 实验结果证明载体pMB-Ara-T可以通过直接克隆rPCR产物的方式选择性地克隆和筛选编码有信号肽序列的跨膜输出蛋白基因。筛选得到的分泌蛋白和膜蛋白基因为进一步研究多杀性巴氏杆菌毒力、免疫原性等相关的跨膜蛋白及其基因的功能和表达调控提供有利基础。