【摘 要】
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细胞色素P450氧化酶（Cytochrome P450,CYP）是一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白超家族,广泛存在于生物体内。CYP在哺乳动物肝脏中含量丰富,主要催化单加氧反应,在很多外源和内源性化合物代谢中发挥关键作用。CYP1A2是肝脏中表达量较高的一种重要CYP,在许多环境污染物的生物活化中发挥显著作用。同时它还参与黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的活化过程,可将AFB1转化为
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细胞色素P450氧化酶（Cytochrome P450,CYP）是一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白超家族,广泛存在于生物体内。CYP在哺乳动物肝脏中含量丰富,主要催化单加氧反应,在很多外源和内源性化合物代谢中发挥关键作用。CYP1A2是肝脏中表达量较高的一种重要CYP,在许多环境污染物的生物活化中发挥显著作用。同时它还参与黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的活化过程,可将AFB1转化为高毒性的AFB1-8,9-环氧化物（AFBO）,AFBO易与DNA结合导致基因突变从而诱发癌症。7-乙氧基试卤灵（7-Ethoxyresorufin,7-ER）是CYP1家族的模式底物,经常被用于CYP1A2的酶活测定。本研究以猪CYP1A2为研究对象,运用多种方法系统比较它催化AFB1和7-ER的机制。本研究首先以人CYP1A2晶体结构为模板,利用SWISS-MODEL自动建模获得了猪CYP1A2的结构模型。以该模型为受体,分别以AFB1和7-ER分子为配体,运用分子对接软件AUTODOCK 4.2进行蛋白受体与小分子配体的对接模拟。根据对接结果,并参考前期研究,初步判定Thr-124、Phe-125、Phe-226、Leu-260和Asp-313可能参与猪CYP1A2与AFB1的结合;而Thr-118、Thr-124、Phe-125、Phe-226和Asp-313可能参与7-ER的底物结合。通过定点突变技术和原核表达纯化,我们获得了猪CYP1A2野生型及T118A、T124A、F125A、F125W、F226A、F226W、L260A、L260F、D313A和D313E突变体蛋白。Fe2+·CO还原光谱显示这些蛋白均具有典型的450 nm特征吸收峰。同时圆二色谱显示所有蛋白的二级结构以α-螺旋为主,表明所表达的蛋白具有正确的结构。为确定特定氨基酸位点在CYP1A2结合底物中的作用,我们比较了CYP1A2野生型及突变体代谢AFB1和7-ER的酶动力学参数。体外孵育实验显示,猪CYP1A2代谢AFB1生成AFBO的kcat值为0.47 min-1,生成AFM1的kcat值为0.63 min-1。突变体F125A、F226A和D313A对AFB1的代谢活性均完全丧失,表明Phe-125、Phe-226和Asp-313是参与AFB1代谢的重要氨基酸。将这些位点分别突变为相似的氨基酸即F125W、F226W和D313E,酶活出现不同程度的恢复。分析显示Phe-125和Phe-226通过CH/π相互作用稳定AFB1的结合;而Asp-313通过氢键与AFB1作用。L260A的催化效率分别为野生型的2%（AFBO）和28%（AFM1）,推测Leu-260通过疏水相互作用稳定AFB1的结合。突变体T124A对AFB1的催化效率(kcat/Km)相比野生型均增强1倍,对接模拟显示二者之间存在氢键作用,该结果表明Thr-124与AFB1之间的氢键对于AFB1的催化并不发挥关键作用。猪CYP1A2代谢7-ER的kcat为5.63 min-1。突变体F125A、F226A和D313A对7-ER的催化效率几乎完全丧失,表明Phe-125、Phe-226和Asp-313是猪CYP1A2代谢7-ER的关键氨基酸。分析显示Phe-125和Phe-226也是通过CH/π相互作用稳定7-ER的结合;Asp-313则通过氢键与7-ER作用。将这些位点分别突变为相似氨基酸即F125W、F226W、D313E,可恢复部分酶活。与野生型相比,突变体T118A和T124A代谢7-ER效率分别减少至23%和60%,表明它们与7-ER形成的氢键对于维持7-ER的结合发挥部分作用。综上所述,Phe-125、Phe-226和Asp-313是猪CYP1A2结合AFB1和7-ER的关键位点,其中Phe-125和Phe-226通过其苯环侧链与底物分子之间形成CH/π相互作用稳定对底物的结合,Asp-313与底物之间的氢键帮助底物催化;Leu-260和Thr-118则分别在AFB1和7-ER的催化中发挥重要作用。本研究揭示了猪CYP1A2催化AFB1和模式底物7-乙氧基试卤灵的分子机制,研究结果对于理解CYP1A2代谢多环芳香底物的机制具有较好的参考价值。
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