细胞程序性坏死是一种不依赖于caspase但可以被RIPK1、RIPK3及MLKL调控的程序性细胞死亡方式。细胞坏死时细胞膜的破裂会导致细胞内容物的释放，细胞曝露在损伤相关的分子模式(DAM Ps)下会诱发炎症，所以在细胞坏死时通常都会伴随着炎症的存在。同时，细胞程序性坏死在肿瘤转移、神经退行性疾病、免疫系统疾病、病毒的感染等多种人类疾病中都有参与。因此如何抑制细胞坏死已经成为很多疾病治疗的重要靶标。　　细胞程序性坏死能够被多种胞内及胞外刺激触发。肿瘤坏死因子TNF-α诱导的程序性坏死是目前研究的最清楚的模型之一。TNF-α与细胞膜上的受体TNFR1结合后会迅速招募TRADD、RIPK1、TRAF2、CYLD等蛋白，这个复合物高度动态化，统称为ComplexⅠ。ComplexⅠ在数分钟内被内吞并解离，在不同的生理/病理条件下转化为不同的复合物，介导细胞凋亡形成ComplexⅡa或者介导细胞坏死形成ComplexⅡb。RIPK1激酶的激活是诱发其与RIPK3相互结合形成ComplexⅡb的关键步骤，该复合物随后招募MLKL，对其磷酸化修饰并诱导其多聚化而转移至细胞膜，导致胞膜通透，使细胞坏死。　　程序性坏死的调控机制仍然存在许多尚未解决的问题，例如:RIPK1是如何被激活的？ComplexⅠ向ComplexⅡ的转变是如何被调控的？本文围绕着这些问题，设计实验展开研究，以期获得更加深入的了解。　　脂筏是细胞膜上由胆固醇和鞘脂组成的一个结构紧密的微区，在信号转导、细胞内的蛋白转运、细胞膜分选及运输和细胞极化中都有重要的作用。我们发现坏死复合体中的关键蛋白RIPK1、RIPK3、MLKL在细胞坏死时会转移到细胞膜上的脂筏中。进一步实验证明，在细胞接受TNF-α刺激后用胆固醇的删除剂甲基-β-环状糊精(Mβ-CD)破坏细胞膜上的脂筏，能够抑制细胞的坏死。因此我们用蔗糖密度梯度离心的方法把脂筏相关组份分离出来，进行蛋白质谱以及脂质小分子质谱组学分析，期望可以鉴定出参与细胞坏死新的调控因子。GO分析显示大部分被富集的蛋白都是膜或者膜相关蛋白，在功能上聚类分析发现主要是参与细胞因子介导的炎症反应信号通路。同时在电镜下观察到脂筏中有囊泡的存在，并且坏死细胞脂筏中的囊泡在数量上较对照组显著增多。小分子脂质质谱结果显示在细胞坏死时，脂筏中神经酰胺的量会上调。已有研究发现细胞坏死时细胞内的神经酰胺是上调的，这与我们的结果是一致的。　　在把质谱结果与实验室以前的siRNA筛选结果综合分析以后，我们选取了一些可能参与细胞坏死调控的候选基因。随后针对每个基因设计了siRNA在不同的细胞坏死模型上验证，最后确认干扰VPS18会抑制细胞坏死。VPS18是细胞内参与蛋白分选转运的一个蛋白，与VPS11、VPS16、VPS33组成VPS-C复合物，主要是参与细胞内内体-溶酶体之间的膜运输。　　在细胞发生坏死时VPS18可以被招募到ComplexⅠ和ComplexⅡb这两个复合物中。用慢病毒shRNA的方法在HT-29细胞中敲低VPS18可以有效的抑制细胞坏死，以及RIPK1和MLKL的磷酸化，但对NF-κB信号通路没有影响。在293T细胞中将VPS18分别与RIPK1、RIPK3、TNFR、CYLD等蛋白共转染，结果显示VPS18与RIPK1之间有相互作用。进一步的研究还发现过表达VPS18会促进RIPK1/RIPK3在细胞内的聚集，并减弱TRAF2与RIPK1之间的相互作用。由此推断，VPS18改变了RIPK1在细胞内的定位。　　VPS-C中除了VPS18，其他三个蛋白与RIPK1之间也有相互作用，在细胞内也具有共定位，并且在过表达VPS-C蛋白后都可以促进RIPK1在细胞内的聚集，干扰VPS11和VPS16也能够有效的抑制细胞的坏死。VPS-C参与了内体-溶酶体、自噬小体-溶酶体的融合过程，为了进一步考察VPS18是否把RIPK1转运到内体-溶酶体系统中，我们运用percoll密度梯度离心的方法分离细胞内的溶酶体。结果显示作为RIPK1激活标志的的S166位磷酸化只出现在发生坏死细胞组密度较轻的第二层（密度约1mg/L）。当在这一层免疫沉淀RIPK1，对与之结合的蛋白进行蛋白质谱鉴定，检测到了RIPK3以及VPS-C。同时，Rab5、Rab7等参与囊泡运输的蛋白也主要第二层中富集，这预示着第二层可能是细胞内的囊泡。在负染以及冷冻电镜下能够更直观的观察到此层中囊泡的结构。　　我们的工作首次发现了VPS-C复合物参与程序性坏死的调控。并且结果显示，RIPK1通过与VPS-C之间的相互作用，被VPS-C形成囊泡介导其在细胞内的转运，促进了与RIPK3等蛋白形成坏死小体。