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第一部分单核细胞分泌GRN活化HSCs促进肝纤维化机制研究目的:肝纤维化(liver fibrosis)是多种慢性肝病进展的共同病理过程,是我国严重的公共卫生问题。近年来研究表明巨噬细胞,特别是单核细胞来源的巨噬细胞可以促进肝纤维化,但其机制仍不清楚。最新研究显示巨噬细胞可以分泌颗粒体蛋白(granulin,GRN)促进纤维化。本研究旨在揭示巨噬细胞及GRN促进肝纤维化的机制,为肝纤维化的治疗寻求新的靶点。方法:首先我们检测了121例慢性肝病患者CLD肝脏中GRN表达,分析GRN与肝脏炎症、纤维化、临床肝病指标的关系,以及在不同原因肝病患者中的表达差异;然后,我们通过腹腔反复注射CCl4和胆管结扎的方式建立小鼠肝纤维化模型,检测不同纤维化模型小鼠不同时期肝脏中GRN表达变化;利用GRN-/-小鼠建立肝纤维化模型,探索GRN对肝纤维化的作用;利用GRN与肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs)系-LX-2共培养,通过q-PCR检测平滑肌肌动蛋白α2(smooth muscle actin alpha 2,ACTα2)和I型胶原α1(collagen type I alpha l,Collα1)等指标,观察GRN对HSCs活化的影响,通过WB检测ERK1/2、P-38、JNK、AKT和NF-κB等蛋白表达和磷酸化水平,探索GRN活化HSCs的机制;利用GRN与巨噬细胞表面分子CD68、F4/80和CD11b荧光共染,观察在肝纤维化期肝脏中GRN表达来源;利用脂质体尾静脉注射去除掉小鼠肝巨噬细胞,观察去除掉巨噬细胞后小鼠肝脏中GRN表达;利用野生型小鼠和GRN-/-小鼠的骨髓单核细胞和肝脏原代HSCs共培养,观察单核细胞来源的巨噬细胞对小鼠肝星状细胞的活化作用。结果:在CLD患者肝脏中GRN表达较普通人明显升高,且与肝脏炎症呈正相关,不同病因之间无明显差异。与CLD患者肝脏临床指标相关性分析发现,肝组织内中GRN+细胞数量与谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷氨酰转肽酶(glutamyl transpeptidase,GGT)、总胆红素(total bilirubin,Tbill)、Child-Pugh评分呈正相关,与白蛋白水平无明显的相关性。在CC14腹腔反复注射和胆管结扎这两种小鼠肝纤维化模型中,GRN表达随着CC14腹腔注射次数增加和胆管结扎时间延长明显增加。在CC14腹腔反复注射建立小鼠肝纤维化模型中,与野生型小鼠相比,GRN-/-小鼠肝脏中α-SMA和Col-1表达明显减轻,炎症因子白介素(interleukin,IL)-4和IL-10降低。GRN与LX-2共培养后,LX-2表达ACTα2和Collαl明显增加,而且ERK1/2和STAT3磷酸化水平明显增加。在CLD患者肝组织免疫荧光中,GRN与CD68共染较普通人明显增多。在普通小鼠肝脏中GRN主要与F4/80荧光共染,而纤维化小鼠模型中GRN与CD11b共染明显增多。相比于普通人CLD患者肝组织切片显示,CD68+细胞数量明显升高。肝纤维化小鼠模型中,F4/80+和CD11b+细胞数量也较空白对照组明显升高。与野生型小鼠相比,GRN-/-小鼠骨髓单核细胞来源的巨噬细胞活化HSCs作用明显减轻。结论:肝纤维化过程中,GRN表达明显升高,与肝脏炎症和纤维化密切相关。拮抗GRN作用后,HSCs活化减轻和肝纤维化缓解。而GRN活化HSCs的作用,与ERK1/2和STAT3磷酸化有关。肝纤维化过程中,GRN主要由单核细胞来源的巨噬细胞分泌。单核细胞来源的巨噬细胞可以通过分泌GRN促进HSCs活化,加重肝纤维化。第二部分姜黄素抑制单核细胞浸润减轻肝纤维化的机制研究目的:既往研究发现姜黄素具有良好的抗肝纤维化作用,但其作用机制尚不清楚。近年来有研究显示姜黄素具有抑制趋化因子分泌和单核细胞浸润的作用。在本研究中,我们旨在研究姜黄素是否可以通过抑制库普弗细胞(Kupffer cells,KCs)活化来减少趋化因子的分泌,从而抑制Ly6Chi单核细胞浸润以及Ly6Chi单核细胞相关的促纤维化细胞因子分泌来缓解肝纤维化。方法:24只小鼠被随机分为三组:空白组、CCl4组和姜黄素组。其中CCl4组和姜黄素组予以CCl4腹腔注射,每周两次,连续四周。空白组小鼠相应予以橄榄油腹腔注射。CMC-NA溶液重悬姜黄素。姜黄素组小鼠每日予以姜黄素灌胃,连续四周,空白组和CCl4组予以相应体积的CMC-NA溶液灌胃。结果:姜黄素给药后,纤维化模型小鼠肝脏炎症和纤维化明显减少。与CCl4组比较,姜黄素组小鼠Ly6Chi单核细胞的肝内浸润明显减少,但其他白细胞亚型无差异。姜黄素显著降低Ly6Chi单核细胞相关促炎性和促纤维化细胞因子分泌,与肝内Ly6Chi单核细胞数量减少相一致。进一步的研究发现姜黄素能够降低KCs活化和肝内单核细胞趋化因子分泌,这解释了姜黄素为什么可以减少肝纤维化过程中的Ly6Chi单核细胞浸润。细胞实验中我们发现姜黄素抑制巨噬细胞向M1型的极化,减少单核细胞趋化因子MCP-1和CCL7的分泌。这与姜黄素抑制ERK1/2和p38通路蛋白磷酸化有关。结论:综上所述,我们首次证实姜黄素可以通过抑制KCs活化来减少趋化因子的分泌,从而抑制Ly6Chi单核细胞浸润以及Ly6Chi单核细胞相关的促纤维化细胞因子分泌来缓解肝纤维化。这些结果提示姜黄素可以作为预防和治疗肝纤维化的候选药物。