猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus PEDV）属于α冠状病毒,可以引起各日龄猪出现水样腹泻、呕吐和脱水,主要导致新生仔猪高死亡率,2010年PEDV发生变异,给全球养殖业带来沉重打击。冠状病毒在感染过程中通过与细胞表面受体结合,病毒和细胞膜融合将其遗传物质释放到细胞内。然而,关于PEDV利用哪些宿主蛋白、通过何种途径进入细胞以及宿主如何防御病毒感染等科学问题尚不完全清楚。膜蛋白在病毒的吸附、内化、运输和释放等过程起到非常重要的作用,随着膜蛋白组学的发展和应用,很多病毒感染相关膜蛋白得以鉴定,大大助推病毒入侵和感染机制的研究。为鉴定PEDV感染相关的细胞膜蛋白,我们通过提取PEDV感染Vero细胞的膜蛋白结合同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ）技术筛选到21个差异表达蛋白,通过对差异蛋白的分析和结合相关文献的研究,进一步聚焦到细胞极性蛋白PARD3（Partitioning defective 3）和非受体型蛋白磷酸酶PTPN14（The Protein tyrosine phosphatase Non-Receptor Type 14）在PEDV感染中的不同功能和具体机制,为揭示PEDV入侵和细胞防御机制奠定基础,具体研究结果如下:1、以重组表达的PEDV-N蛋白和浓缩纯化的PEDV病毒粒子为免疫原,成功筛选到抗PEDV N蛋白和S蛋白的单克隆抗体,为后续病毒蛋白表达的检测与病毒定位研究奠定基础。2、PEDV感染Vero细胞在胰蛋白酶的作用下能够形成典型的合胞体病变,使膜蛋白形态发生显著变化,为研究哪些蛋白参与了此过程,我们通过提取细胞膜蛋白并利用i TRAQ和MALDI-TOF MS/MS技术成功鉴定到21个差异表达蛋白,其中10个上调表达,11个下调表达。对差异蛋白进行分类分析发现相关蛋白功能与细胞极性、胞内物质运输、磷酸蛋白酶、组蛋白和乙酰化等相关,其中12个蛋白均为PEDV感染的细胞中首次鉴定到的差异蛋白,可为PEDV感染与入侵机制提供新的线索。3、通过对差异蛋白进行分析和鉴定,发现极性相关蛋白PARD3在PEDV感染后表达显著下调,PARD3是PDZ家族蛋白,其在细胞极性和紧密连接的形成中发挥着重要作用。利用Western blot和IFA发现不同的PEDV毒株感染均可导致PARD3下调表达和细胞定位的改变;进一步发现PEDV是通过泛素-蛋白酶途径导致PARD3降解;敲减PARD3能够破坏细胞的紧密连接,促进了病毒的吸附和内化,而且对细胞基底侧的感染也显著增强,还促进了PEDV引起的细胞凋亡。紧密连接使上皮细胞形成物理屏障,这是一种先天免疫机制,可阻止病毒感染,PEDV通过降解PARD3而影响细胞屏障功能,表明PARD3可能是一种潜在的抗PEDV感染的新型抗病毒蛋白。4、PTPN14是一种非受体蛋白酪氨酸磷酸酶,在细胞间粘附、细胞迁移、细胞生长等方面发挥调节作用。在本研究中我们发现PTPN14在PEDV感染后上调表达,并且是STAT3磷酸化的负性调节蛋白。STAT3是参与PEDV感染的重要宿主蛋白,其活化受到蛋白激酶和磷酸酶的精确调控,PEDV感染Vero细胞后,STAT3磷酸化随着病毒感染逐渐下降,PTPN14表达逐渐增多,二者呈现出相反的表达趋势;通过si RNA下调PTPN14以及磷酸酶抑制剂来抑制磷酸酶,能够显著促进PEDV的增殖;进一步的研究发现PTPN14和磷酸酶抑制剂能够调节STAT3的磷酸化,而且PTPN14对STAT3的去磷酸化是发生在细胞质,而不是细胞核中。这是在PEDV感染中,发现首个调节STAT3去磷酸化的磷酸蛋白酶,能够帮助我们更深入的理解PEDV感染机制,尤其是胞内蛋白去磷酸化的调节机制。综上所述,本研究通过提取PEDV感染Vero细胞中的膜蛋白通过蛋白组学鉴定了差异表达的蛋白,通过对极性相关蛋白PARD3和磷酸酶PTPN14的进一步研究,揭示了细胞极性和磷酸酶在PEDV感染中的机制和影响,可望为PEDV入侵和宿主防御机制研究提供新的科学依据。