颠茄（Atropa belladonna）属于茄科（Solanaceae）颠茄属（Atropa）多年生草本植物,是中国药典收录的生产以莨菪碱（Hyoscyamine）为主要生物碱的商业药源植物。莨菪碱在颠茄根中特异性合成并可转运到其他器官存贮,在临床上莨菪碱具有多种用途,如治疗晕动症、农药中毒和戒毒脱瘾等。医药市场对于莨菪碱的需求巨大,虽然莨菪碱可以通过化学方法全合成,但这种方法成本太高而未能商业化。目前,莨菪碱的生产完全依赖于从天然植物中提取,但是其在颠茄中的含量很低。植物基因工程技术已被证明是培育高价值次生代谢产物高产植物最为有效的手段之一,本文将开展小G蛋白（Rac GTPase,Rac）突变体提高颠茄中莨菪碱含量的研究。Rac是一类具有GTP酶活性的单体蛋白,在动物和植物中该蛋白质的氨基酸序列高度保守。Rac不仅在植物生长发育和诸多生理过程中发挥重要作用,而且能够调控植物生物碱和萜类等次生代谢产物的生物合成。已有研究报道,Rac的GTP结合位点G突变为V或Q突变为L均能降低其GTP酶活性,减少GTP的水解,达到永久结合GTP的目的。本研究从颠茄中克隆了一个Rac基因（AbRac）并分析了该基因组织表达模式;在颠茄中过表达AbRac蛋白及其突变体AbRac^G15V和AbRac^Q64L,研究其对莨菪碱生物合成的影响。本研究获得如下实验结果:1.AbRac基因克隆和表达分析将功能明确的野甘草Rac GTPase在颠茄转录组数据库中比对,找到一条颠茄的小G蛋白基因,将其命名为AbRac,随后克隆了该基因591 bp的编码区。AbRac与已经报道的Rac在氨基酸序列上具有极高相似度。将AbRac第15位甘氨酸（G15）突变成缬氨酸（V15）,获得AbRac突变体AbRac^G15V;将第64位的谷氨酰胺（Q64）突变成亮氨酸（L64）获得AbRac突变体AbRac^Q64L。通过实时荧光定量PCR,检测AbRac在颠茄主根、须根、茎、叶中的相对表达量。AbRac在各个组织中都有表达,但其表达量有差异,在主根中的表达量最高,在须根和叶中的表达量较高,在茎中的表达量较低。2.过表达AbRac突变体的转基因颠茄T0代的培育和相关检测以p2301⁺质粒作为植物表达载体,用双酶切法构建重组质粒p2301⁺-AbRac,p2301⁺-AbRac^G15V,p2301⁺-AbRac^Q64L,将这三种重组质粒和空载体用冻融法分别转入根癌农杆菌EHA105,获得工程菌株EHA105-p2301⁺-AbRac、EHA105-p2301⁺-AbRac^G15V和EHA105-p2301⁺-AbRac^Q64L。用叶盘法转化野生型颠茄植株,通过卡那霉素筛选获得抗性植株。经过PCR和qPCR分子检测,获得独立转化的转基因植株,包括过表达AbRac转基因植株3株,过表达AbRac^G15V转基因颠茄3株,过表达AbRac^Q64L转基因颠茄2株。同时获得了3株p2301⁺独立转化的颠茄植株作为空载体对照并快繁了10株野生型颠茄作为非转基因对照。PCR检测结果表明,在转基因材料中均能够检测到795 bp的卡那霉素抗性基因（NPTII）片段,而在野生型颠茄中未能检测到该片段;在转AbRac及其突变体材料中均能检测到677 bp的35S启动子和AbRac及其突变体的融合片段;同时qPCR检测结果表明,在转AbRac及突变体材料中,AbRac/AbRac^G15V/AbRac^Q64L的表达量得到了大幅度提高。对转AbRac/AbRac^G15V/AbRac^Q64L的材料进行快繁,每个独立转化植株不少于3株快繁材料。经炼苗移栽后,分别提取根和叶片中的莨菪碱,用HPLC检测其含量。结果表明,野生型、空质粒对照和转AbRac（分别为三种不同类型的对照）的植株根中莨菪碱含量处于同一水平,且无显著性差异;在过表达AbRac^G15V/AbRac^Q64L的转基因植株根中,其莨菪碱含量比三种对照植株根中的莨菪碱含量均有显著提高。三种对照植株叶片中莨菪碱含量也处于同一水平,无显著性差异;在过表达AbRac^G15V/AbRac^Q64L的转基因植株叶片中,其东莨菪碱含量比对照均有显著性提高。采用qPCR分析了这些材料中参与莨菪碱生物合成的基因PMT、TRI和CYP80F1的表达量,结果表明,在过表达AbRac^G15V/AbRac^Q64L材料中,TRI基因的表达量得到了大幅度提高,而PMT和CYP80F1基因表达量没有变化。上述结果表明,与野生型颠茄比较,空质粒对照和过表达AbRac的颠茄中莨菪碱含量没有显著性变化;而过表达AbRac^G15V或AbRac^Q64L都能够提高颠茄中莨菪碱含量。3.2.过表达AbRac突变体的转基因颠茄T1代的培育和相关检测为进一步研究转基因材料中莨菪碱含量的提高在其有性生殖后代中是否也有类似表现,对3个过表达AbRac^G15V株系和2个过表达AbRac^Q64L株系都进行了套袋自交,获得T1代种子。经萌发成苗和田间种植后,进行基因表达和莨菪碱含量测定。由于T0代结果显示三种对照的莨菪碱含量无显著性差异,在T1代测试中,就采用野生型颠茄实生苗为对照。分子检测结果表明,在过表达AbRac^G15V/AbRac^Q64L颠茄T1代实生苗中,均能检测到795 bp的NPTII片段和677bp的35S::AbRac^G15V/AbRac^Q64L片段,而在野生型颠茄中都未能检测这些基因片段;qPCR结果显示在过表达AbRac^G15V/AbRac^Q64L颠茄T1代实生苗根中,其表达水平远高于野生型;同时转基因颠茄根中TRI表达量也得到极显著提高。同样采用HPLC分析了颠茄根和叶片中莨菪碱含量。结果表明,过表达AbRac^G15V/AbRac^Q64L颠茄T1代材料的根和叶片中的莨菪碱含量均显著性高于野生型颠茄。T1代转基因颠茄材料测试结果表明,转AbRac突变体材料其基因表达和莨菪碱含量与T0代的结果吻合,意味着该转基因所带来的表型在遗传上是稳定的。综上所诉,本研究从颠茄中克隆了AbRac基因,并构建了过表达该基因及其突变体的转基因材料,发现过表达AbRac突变体AbRac^G15V或AbRac^Q64L都能够大幅度提高颠茄TRI基因表达,并最终导致转基因颠茄中莨菪碱含量的提高。