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以田间种植多年生冬凌草为材料,研究了外植体类型、外植体消毒时间、培养基组分、培养条件对冬凌草愈伤组织诱导、继代及悬浮培养的影响,结果发现冬凌草的茎为研究的最适外植体,茎的最适消毒时间为3min,MS基本培养基附加2.4—D1.0mg/L、NAA0.5mg/L、6—BA0.1mg/L,30g/L蔗糖为最佳培养基。在50mL固体培养基中接入1g(鲜重)的愈伤组织,置于25~27℃、黑暗条件下培养,继代6次后,愈伤组织增长倍数稳定,不易褐化、更易于培养。研究了在冬凌草悬浮培养的不同时期添加不同浓度的两种稀土离子镧、亚铈对冬凌草细胞分泌和释放冬凌草甲素的影响。结果表明,在悬浮培养初期、指数期、稳定期加入稀土元素,不同种类、不同浓度的稀土离子对细胞合成冬凌草甲素影响强弱不同,但均促进了冬凌草甲素的合成。其中,在稳定期,加入镧溶液10×10—4mmol/L的培养液中,获得的冬凌草甲素含量最高。在培养指数期添加稀土元素使悬浮培养细胞生长曲线产生较大的变化.整体上使细胞生物量减少。
筛选高产细胞株系,以大幅度提高有用次生代谢产物的含量,是建立植物细胞生物反应器技术中降低成本和提高生产率的重要途径之一。培养基适宜的pH值、细胞生长年龄与合适的接种方式是细胞团生成成败的关键。本研究主要从接种方式、细胞生长年龄、pH值对细胞团生成的影响进行讨论。结果表明,经过两层纱布与一层纱布过滤的滤液,有细胞团生成。条件培养基和看护培养基中细胞团数较多。处于旺盛分裂期即指数生长期(悬浮培养12d左右)的冬凌草细胞,细胞团生成数量最多。冬凌草细胞团生成的最适pH值为5.81。实验中建立了38个细胞株系,经悬浮培养,利用薄层层析法和紫外分光光度法,筛选出3个高产优质细胞株系。
本研究对冬凌草细胞进行了优化培养,筛选出冬凌草甲素含量较高的细胞株系,已初步建立起冬凌草细胞生物反应器技术。