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阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease, AD)是一种神经退行性疾病,它引起记忆力进行性减退而导致痴呆的发生,并最终导致患者死亡。病理学研究发现AD患者出现了三个特征性的病理改变:一是β-淀粉样蛋白肽在神经细胞外沉积形成神经炎性斑块;二是神经细胞内形成神经纤维缠结;三是神经元的原发性变性。然而,有关的发病机制迄今未被阐明。大量的证据表明,早老素 1(PS-1) 的突变是引起早发性家族性阿尔兹海默病(EOFAD)的主要因素。但是PS-1突变引起 Alzheimer病认知功能损害的具体机制还不清楚。一些研究提示早老素作为一种具有多个跨膜区域的跨膜蛋白,当其发生突变后可能通过调节γ-分泌酶的活性,影响了包括β-淀粉样前体蛋白和Notch蛋白在内的一系列蛋白跨膜区域的酶解,进而导致细胞功能障碍的发生。先前,我们通过转染突变型PS-1和野生型PS-1入RA诱导后呈现胆碱能神经元表型的PC12细胞(模型化的PC12细胞),研究了早老素1的突变对模型化PC12细胞细胞增殖和分化、形态学,胆碱乙酰基转移酶和乙酰胆碱脂酶活性变化的影响,结果证实PS-1基因的突变造成了模型化的PC12细胞细胞增殖减慢,胆碱乙酰基转移酶和乙酰胆碱脂酶活性的下降和细胞凋亡增加(尤其是在无血清培养的情况下),进一步证实PS-1基因突变与AD发病之间存在密切关系,也为本研究进一步寻找PS-1基因突变诱导细胞凋亡的新基因或相关基因提供了前提,为从分子水平探讨PS-1突变与AD发病机制的关系创造了条件。为了进一步寻找PS-1基因突变引起细胞凋亡的相关基因,探讨PS-1引起神经细胞凋亡的机制,在本项研究中,我们应用mRNA差异显示技术对转染突变型PS-1和野生型 PS-1的模型化PC12细胞的基因表达变化进行了研究。在转染、筛选并获得稳定表达突变型PS-1和野生型PS-1模型化的PC12细胞克隆后,使用3个锚定引物和8个随机引物,进行RT-PCR反应,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA条带。与传统应用放射自显影来显示DNA条带的方法不同,我们采用了银染法来显示DNA条带,我们发现银染显色同样可以清晰地显示DNA电泳条带,也不影响后续的实验,如回收、扩增、克隆和测序等,同时银染显色避免了放射性的潜在危害。而且与放射自显影间接确认和切取差异条带相比,银染显色由于能够在直视下辨别和切取差异条带,因而更加直观、准确。银染差异<WP=10>显示不失为一项十分有益、有用的,值得推广的方法。在本研究中,成功地对31个差异条带进行了回收、再扩增、T载体克隆和序列测定,并选择其中的8个片段进行了反向Northern杂交验证。8个差异片段中有6个差异片段得到证实,其中2个片段在转染突变型PS-1的模型化PC12细胞中高表达;另外4个片段在转染突变型PS-1的模型化PC12细胞中低表达。剩余的2个片段中,一个片段为阳性无差异, 另一个片段为阴性无差异。杂交证实的阳性片段在Genbank上进行了BLAST同源性检索。2个在突变型PS-1细胞中高表达的片段,有一个与褐家鼠29型内质网蛋白(endoplasmic reticulum protein 29,ERp29)基因具有高度的同源性。既往研究表明29型内质网蛋白是一种定位于高尔基体和内质网的蛋白,它能促进分泌型蛋白在内质网的折叠和(或)输出,从而使其进入内质网腔或从内质网离开。 另外,ERp29的表达增高是由内质网应激引起的,也就是在内质网出现了错误折叠蛋白聚积的情况。细胞由此产生了一系列防卫性反应以缓解内质网应激状况,这种防卫性反应称为未折叠蛋白反应。既往研究发现PS-1突变与内质网应激有密切关系,一些研究发现突变PS1通过减少IRE1和PERK的激活干扰了未折叠蛋白反应。综合上述研究结果,我们推测PS1作为γ-分泌酶的组成成分之一,其突变后影响了一系列跨膜蛋白的正确酶解,而异常酶解的蛋白在内质网内聚积导致了内质网应激的发生。此外,突变PS1还干扰了一系列未折叠蛋白反应而加重了内质网应激的程度。作为未折叠蛋白反应的一种形式,ERp29表达增强有助于缓解细胞的内质网应激状况,而且ERp29的表达增强似乎不受突变PS1的干扰。如果内质网应激不能得到有效缓解,将导致细胞凋亡的发生。另外的一个片段没有在GenBank上找到同源性,其功能还不清楚。4个在野生型PS-1细胞中高表达的片段,2个片段分别与小鼠19型胶原蛋白(19(XIX) collagen gene, Col19a1)基因和小鼠溶质载体家族35 F2(solute carrier family member F2,SLC35F2)基因有同源性。既往研究表明Col19a1的组织表达水平在胚胎发育期间和成年体内是不同的,胚胎发育期间Col19a1广泛表达于除肝脏以外的胚胎组织中;但在成年体内,只有大脑、眼和睾丸等少数几种组织中有Col19a1表达,特别是在成年脑组织中,Col19a1的表达水平与胚胎发育期间相比,至少增加了10倍,因此推测其在维持成年动物神经细胞功能方面具有重要作用。结合本研究结果,我们推测突变型PS-1细胞中Col19a1表达水平的下降有可能是导致神经细胞功能损害的原因之一。早先有关SLC35的报道非常罕见,新近有作者报道指出SLC35基因编码的蛋白是位于高尔基器和(或)内质网的一类转运蛋白,这类转运蛋白的主要功能是将核糖从细胞质转运至细胞器内腔,在那里合成为复合糖并参与一些蛋白的糖基化修饰。据此我们推测SLC35F2编码的蛋白<WP=11>不足可能导致了细胞部分核糖转运