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马立克氏病(Mareks disease,MD)是由疱疹病毒引起的一种鸡恶性T淋巴细胞增生性疾病,对养禽业危害极大。目前以疫苗免疫和生物安全为主的防制手段已经不能很好的控制MD,因此抗病育种将成为一个重要的策略。抗病育种主要采用遗传学方法即通过相应的MD抗性相关基因(Mareksdisease resistance-related genes,MDRLGs)的检测来选育抗性的个体,从遗传本质上提高鸡只对MD的抗性。目前,在其他品种鸡研究的MDRLGs主要包括生长激素(growth hormone,GH)基因、主要组织相容性复合物(maiorhistocompatibility complex,MHC)的B-L和B-F基因、白细胞介素18(Interleukin-18,IL-18)基因等,据报道它们在鸡只外周血淋巴白细胞中的表达水平与抗性相关。应用敏感性极高的实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)进行基因表达水平差异的研究是一种有效而常用的技术,通过克隆这些基因,获得其重组标准品质粒并建立其相应的标准曲线将是开展这一研究工作的基础。
本课题从抽提自霞烟鸡鸡外周血淋巴白细胞的总mRNA中应用逆转录酶—聚合酶链式反应(reverse-transcriptase polvmerase chain reaction,RT-PCR)扩增出GH基因、B-L基因和IL-18基因的cDNA,将纯化的cDNA克隆到pGM-T载体上。重组质粒通过PCR和EcoR错误!未找到引用源。酶切鉴定及测序分析,证明GH基因、B-L基因和IL-18基因已经成功重组到pGM-T载体上;将浓度梯度的GH基因、B-L基因和IL-18基因的重组标准品质粒DNA进行RQ-PCR,建立其相应的标准曲线。经分析显示各标准曲线的Ct值与其标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系;扩增曲线分析表明,在建立的反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度都达到10拷贝/反应。结果表明,本课题成功构建了用于检测GH基因、B-L基因和IL-18基因表达水平的标准品质粒和标准曲线,为下一步应用RQ-PCR技术检测GH基因、B-L基因和IL-18基因的表达水平打下基础。
对不同样本中特定基因的mRNA表达水平进行比较分析时,各样品的起始细胞数、RNA的提取效率以及反转录效率不同。因此,需要同时对不同样品中作为内参的管家基因(housekeeping gene)进行RQ-PCR,以此对目的基因的定量结果进行校正。3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是体内参与糖酵解的一种关键酶,其编码的基因是最为常用的内参之一。应用RT-PCR从霞烟鸡鸡外周血淋巴白细胞的总mRNA中逆转录扩增GAPDH基因转录子的cDNA,并将纯化的cDNA克隆到pGM-T载体上。重组质粒经PCR和EcoR错误!未找到引用源。酶切鉴定及测序分析,证实GAPDH基因成功重组到pGM-T载体上。将梯度浓度的GAPDH基因重组标准品质粒DNA进行RQ-PCR,建立其标准曲线。扩增曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度都达到10拷贝/反应。经分析显示标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系。结果表明,本课题成功构建了用于检测GAPDH基因表达水平的标准品质粒和标准曲线,为下一步对MD抗性相关基因的RQ-PCR检测提供了内参。
本课题成功建立了用于检测不同MD抗性能力的鸡外周血淋巴白细胞中GH基因、B-L基因和IL-18基因等MDRLGs以及作为内参的GAPDH基因的mRNA表达水平的RQ-PCR方法,为霞烟鸡MD抗性相关基因的筛选工作奠定了基础。