H9N2-型禽流感病毒在我国广泛流行和存在,不仅给养禽业带来巨大危害,且能够跨越种属屏障获得了感染人等哺乳动物的能力,还因其易发生变异和重组,可作为内部基因组供体,将其他亚型的禽流感病毒“引渡”到人群中,对人类的健康造成了极大的威胁。自1956年我国从国外引种开始饲养毛皮动物以来,养貂规模不断扩大,但养貂场养殖模式不规范、管理水平参差不齐,长期饲喂禽类副产品及貂舍暴露于外界易接触飞鸟粪便、羽屑等状况,使水貂感染流感病毒的风险日益加大,致使我们期望全面掌握我国养殖水貂中感染流感病毒的情况及其危害,研究水貂是否可以作为“病毒携带者”或“中间宿主”在流感病毒传播过程中起到推波助澜的作用。所以本文通过水貂群中流感病毒血清学调查、流感病毒的分离鉴定、对分离毒株的生物学特性研究和全基因测序分析、H9N2亚型禽源禽流感分离株对水貂致病性的研究及水貂呼吸道组织中流感受体的分布分析,系统研究了H9N2亚型禽流感病毒对水貂的感染情况。首先,为评估水貂感染H9N2禽流感的风险,在山东省不同地区采集血清样品560份,开展了禽流感H9N2亚型抗体的血清学调查。HI试验显示,被检血清中对A/Chicken/Hebei/4/2008 (H9N2)和A/chicken/Shanghai/10/01 (H9N2)抗原的阳性反应百分比分别为45.4%和47.5%。无论在成年貂还是幼貂中,H9N2禽流感的抗体阳性普遍存在,阳性率高达40%以上。说明山东省不同养殖区域貂群均不同程度地感染禽流感H9亚型病毒,具有重大的感染风险。血清学调查提示养殖水貂中存在感染H9N2禽流感病毒的风险,所以本研究试图从水貂中分离得到H9N2病毒株,并进行全面的生物学特性研究。2014年从一只有咳嗽、发热、流鼻涕症状的发病水貂分离得到一株流感病毒,经鉴定为H9N2亚型流感病毒,命名为A/Mink/Shandong/wm/2014(H9N2).生物学特性分析表明,接种SPF鸡后,该分离株对SPF鸡致病性较低,未表现明显临床症状,属低致病性流感病毒。但接种小鼠后可引起小鼠显著的临床变化,肺部明显水肿、淤血和出血；病毒可在在小鼠体内复制并引起小鼠发病,说明该株病毒对小鼠的致病性较强。对该分离株8个基因片段进行分子遗传进化分析表明,HA基因属于Y280-like分支,M基因属于G1-like分支,NA、NP、NS、PB1、PB2、PA基因均属于F98-like分支,说明该毒株是一株H9N2大陆流行谱系的低致病性禽流感病毒。与近两年在山东及其周边地区流行的H0N2禽流感分离株同源性较高,其中M、NS、NP、PA、PB1基因与多株H7N9毒株同源性较高,说明这些基因片段与H7N9分离株有相同的来源。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSRSSR↓GL,符合低致病性禽流感的特征。HA基因含有8个潜在糖基化位点,与经典毒株Y280相比,在313位和551位出现两个潜在的糖基化位点。HA基因受体结合相关位点发生了N191H与E198T的突变；Q234L发生突变,具有了与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特性。NA基因有7个潜在的糖基化位点,在其茎部缺失3个氨基酸,造成61位潜在糖基化位点的缺失；三处红细胞受体结合位点在368位点(K→N)、400(S→N)及401(D→E)三处氨基酸发生突变,而且368位点的突变与同源性较高的近几年H9N2的流行株突变相同。HA与NA基因这些位点的突变与缺失是否与其宿主范围扩大和对哺乳动物致病性增强有关,有待于进一步研究。M2基因出现了S31N变异,说明该病毒可能对离子通道抑制剂类药物不敏感。为研究禽源H9N2亚型禽流感病毒对水貂的致病性,本试验通过鼻腔接种Ck/HB/4/08分离株感染幼貂,观察其临床症状、病理变化、各脏器感染情况、排毒情况及抗体变化。结果显示,攻毒后水貂未出现明显的临床症状；但肺脏淤血,局部轻微实变。感染后第3、7d的肺脏中均可检测到病毒。攻毒后3-11d内均可在鼻拭子中检测到病毒。攻毒后第7d抗体水平开始升高,持续到第15d。表明禽源H9N2亚型禽流感病毒可以直接感染水貂,且对水貂造成了一定的致病性,临床症状不显著,病毒可在其体内有效复制,并可向外排毒。为了检测唾液酸受体在水貂呼吸道组织中的类型和分布,本研究利用免疫组化方法对水貂呼吸道组织进行了禽型SAa-2,3Gal受体和人型SAa-2,6Gal受体两种受体的分析。分析显示,两种唾液酸受体在水貂的呼吸道组织中均有表达,但以SAa-2,6Gal受体为主,尤其在上呼吸道以SAa2,6Gal受体表达较多,说明水貂呼吸道含有人型与禽型两种受体,提示水貂可能作为一种甲型流感病毒“基因混合器”或“中间宿主”。总之,本研究提供了临床和实验室两方面的研究资料,提示H9N2亚型流感病毒在养殖水貂中普遍存在,病毒可以感染水貂,引起水貂发病,病毒可在水貂体内复制并向外排毒。禽源流感病毒传播到了水貂中,使水貂成为病毒的侵入者和携带者,提醒我们务必加强水貂群中流感病毒的监测,对防控禽流感以及人类流感大流行均具有的重要意义。