脑卒中(Strok e)是一种突然起病的脑部血液循环障碍性疾病,临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征。缺血性卒中(ischemic stroke)占脑卒中病人总数的80-90%,是严重危害人类健康的常见病、多发病,其致死率及致残率高,给人民生活带来巨大的负担。缺血性卒中的发病危险因素有很多种,包括糖尿病、肥胖、高血压、血液黏度、心脏病等。既往有研究显示血清尿酸(uricacid, UA)通常与导致动脉粥样硬化以及代谢紊乱的危险因素同时存在,血清尿酸的升高与缺血性卒中的发病和死亡率相关。但是,有学者通过实验得到了相反的研究结果,他们认为缺血性卒中引起一连串级联的代谢事件,产生大量的自由基,从而导致了中枢神经系统的氧化损伤,而尿酸具有清除自由基作用,对缺血性卒中起到保护作用。并且,国外有学者通过大规模的临床研究,结果也表明尿酸升高是缺血性卒中预后良好的保护因素。可见,目前国内外学者对尿酸和缺血性卒中预后的相关性研究结果报道不一。而且,多高的尿酸水平才有利于患者的预后?目前国内外少见报道。缺血性脑卒中的发病具有异源性,根据Org10172急性卒中治疗试验(The Trial of Org10172 in Acute Stroke Treatment, TOAST)标准,可分为大动脉粥样硬化型(Large-artery atherosclerosis,LAA)、小动脉闭塞型(Small-artery occlusion lacunar, SAA)、心源性脑栓塞型(Cardioembolism, CE)、其他明确病因型(Stroke of other demonstrated etiology, SOE)和不明病因型(Stroke of other undemonstrated etiology, SUE)5种。各种类型缺血性卒中的发病机制、临床表现和预后均有不同。LAA和SAA型卒中是缺血性卒中的主要病因,且两者从本质上来讲与血管壁动脉硬化相关,可合并为非心源性缺血性卒中(non-cardioembolic ischemic stroke, NCIS)。缺血性卒中是严重危害人类健康的重要疾病,确定在人群中普遍存在的可以干预的因素,并加以干预对预防和治疗缺血性卒中至关重要,而血清尿酸可能就是这样一种因素。我们拟对非心源性缺血性卒中与血清尿酸的关系进行研究,探讨急性期尿酸与患者的入院病情、卒中进展、脑梗死体积和预后是否相关,并进一步探讨多高的尿酸水平才有利于患者的预后。在研究中采用缺血性卒中病因分型,针对非心源性缺血性卒中进行研究,一方面因为每种型别卒中的样本量减少,会使统计学把握度下降;但另一方面,亚型分析基于特定的病理生理机制,会增加所研究性状的同质性。权衡利弊,采用分型的策略更有利于探讨尿酸与缺血性卒中的相关性。随着分子生物学和神经科学研究的进展,人们认识到脑血管疾病的发病、病理生理过程均与一些基因的表达和调控有着密切的关系。因此,从分子和基因水平对缺血性卒中进行研究,探讨通过基因的调控来预防和治疗这类疾病已经成为脑血管疾病研究的热点之一。缺血性卒中的遗传因素研究,不仅可以提供寻找缺血性卒中病因的线索,还可以为缺血性卒中的预防、诊断、治疗及预后提供理论基础。尽管目前国内外学者对尿酸在缺血性卒中发病和预后中的作用存在争议,但是尿酸犹如其他已确定或提出的卒中危险因素一样,参与了缺血性卒中的发生、发展以及治疗和预后的全过程,这个观点已得到愈来愈多的学者认可。而目前,葡萄糖转运蛋白-9(Facilitated Glucose Transporter 9, GLUT-9)基因多态性对血清尿酸水平的影响也渐成共识。GLUT-9基因位于4p15.3-p16,全长214 025 bp,含1个非编码区外显子和13个编码区外显子,编码葡萄糖转运体9(glucose transporter9, GLUT9),参与葡萄糖、果糖和尿酸等的代谢,在动脉硬化的发病中起着重要作用。既往研究证实GLUT-9基因突变可导致基因功能缺失,从而导致肾脏失去重吸收尿酸能力,引起低尿酸血症。在对多个国家的白种人群运用基因芯片进行全基因组扫描分析中,发现GLUT-9基因的遗传变异与血清尿酸水平相关。这种相关性映射于非编码区的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,定位于基因的5’-非翻译区附近和内含子3-7内。目前,已有GLUT-9基因启动子区SNP与高尿酸血症、痛风、糖尿病和冠心病的相关性研究,尚未见对GLUT-9基因启动子区SNP与缺血性卒中的相关性研究。为进一步探索GLUT-9基因多态性与血清尿酸和缺血性卒中的关系,本研究采用生物信息学分析软件对GLUT-9基因的核心启动子区域进行生物信息学预测。检测非心源性缺血性卒中患者GLUT-9基因启动子区SNP位点,并对潜在的转录因子结合位点进行分析,希望发现GLUT-9基因启动子区基因型变异与缺血性卒中患者血清尿酸水平和临床表型特征的关系,为今后深入研究缺血性脑卒中的发病机制奠定基础。第一部分血清尿酸水平与非心源性缺血性卒中的相关性研究一研究对象和方法本研究对象均来源于广州医科大学附属第二医院2011年1月至2014年4月连续登记在库的缺血性卒中患者。非心源性缺血性卒中入选标准为：(1)按Kidwell分类诊断为“肯定脑卒中患者”；(2)根据缺血性脑卒中TOAST分类标准诊断为LAA和SAA型脑卒中。排除标准：(1)短暂性脑缺血发作、脑出血、脑肿瘤、脑外伤；(2)有严重肾脏和肝脏疾病；(3)自身免疫性疾病史以及白血病、多发性骨髓瘤等明确肿瘤病史。进展性卒中诊断标准：发病后1周内,神经缺损症状及体征进行性加重；国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS)评分增加2分以上,并排除继发性脑出血。收集的临床资料包括年龄、性别、高血压病、糖尿病、血脂异常、缺血性心脏病、短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack, TIA)、卒中史、吸烟、饮酒和家族史。采用尿酸酶—过氧化物酶法检测患者血清尿酸。收集头颅MR、DSA、心脏彩超、颈动脉超声等特殊检查结果,对患者进行TOAST分型。使用开放源图像处理软件OsiriX计算获得急性脑梗死灶体积。收集患者入院NIHSS评分和出院改良Rankin量表(modified Rankin scale, mRS)评分,根据出院时mRS评分对患者进行分组。mRS评分0-2分为预后良好(预后良好组),mRS评分3-6分为顶后不良(预后不良组)采用SPSS 13.0统计学软件进行数据统计分析,各分析资料缺失率较小,通过个案删除法将存在缺失值的个案删除。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov检验和Shapiro-Wilk检验进行正态性检验,符合正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验(方差齐)或t’(方差不齐)检验,多组间比较采用单因素方差分析；非正态分布计量资料用中位数(Median, M)和四分位数间距(Inter quartile range, IQR)表示,组间比较采用两组或多组秩和检验。计数资料用频数、百分数(%)表示,四格表资料采用四格表卡方检验或四格表Fisher’s exact检验,多个样本率间的比较采用R×C无序列联表卡方检验或者RxC无序列联表Fisher’s exact检验。通过单因素和多因素Logistic回归分析评价影响患者预后的因素。按α=0.05的检验水准分析组间各指标之间是否有统计学意义。二结果1.研究对象的一般临床特点：连续收集我院2012年1月至2014年4月就诊的LAA和SAA型缺血性卒中患者为研究对象(合并为非心源性缺血性卒中),共收集资料完整的非心源性缺血性卒中患者516例,平均年龄(66.252±12.850)岁,男性308例(59.7%),女性208例(40.3%)。患者的尿酸水平为336.5(131.8) μmol/L,最高尿酸水平为658μmol/L,最低尿酸水平为103μmol/L。非心源性缺血性卒中人群血清尿酸频数分布呈正偏态分布。其中LAA型缺血性卒中157例(30.4%)、SAA型缺血性卒中359例(69.6%)。2.不同血清尿酸水平非心源性缺血性卒中患者的临床特征比较为进一步分析血清尿酸与非心源性缺血性卒中病情严重程度、进展卒中和预后等临床特征的关系,按血清尿酸浓度的20%、40%、60%和80%百分位数将患者分为5组进行比较,这四个百分位数截取点分别为259、310、366和425μmol/L。分析发现,五组间年龄、TOAST分型、NIHSS≥12分和进展卒中比例差异无统计学意义。而第一分位数组(≤259 μ mol/L)男性比例最低,预后不良发生率最高,与其它四组比较,差异有统计学意义(均p<0.05)。3.不同血清尿酸水平患者脑梗死体积比较入院尿酸≤259μmol/L和>259μmol/L组的脑梗死体积分别为[中位数(四分位间距)][1.512(7.894)]cm3和[1.018(3.363)]cm3.与入院尿酸>259μmol/L组比较,≤259gmol/L组脑梗死体积较大,组间比较差异有统计学意义(Z=2.032,p=0.042)。4.急性期血清尿酸对患者预后判别能力的分析根据出院时所评定mRS评分将患者分为预后良好组(mRS评分≤2分)和预后不良组(mRS评分>3分)。预后良好组342例(66.3%),预后不良组174例(33.7%)。以转归不良作为因变量进行单因素logistic回归分析,结果显示：高龄(优势比(odds ratio,OR):1.028,95%可信区间(confidence interval, CI):1.013～1.043；p<0.001).既往卒中(OR:2.112,95％CI:1.349～3.304: p=0.001).NIHSS≥12分(OR:24.497,95％CI:7.370～81.419；p=0.001)和入院尿酸≤259 μ mol/L(OR:2.091,95％CI:1.346～3.246；p=0.001)是预后不良的危险因素。采用向前逐步法对上述各项临床指标进行多因素logistic回归分析,按照患者获得不良预后的概率来拟合回归模型,探讨哪些指标是影响患者预后的独立危险因素。结果显示：高龄(OR:1.029,95％CI:1.012～1.046:p=0.001)、既往卒中(OR:1.796,95％CI:1.097～2.942；p=0.020).NIHSS ≥12分(OR:24.485,95％CI:7.168～83.634；p<0.001)和入院血清尿酸≤259u mol/L(OR:2.069,95％CI:1.282～3.338；p=0.003)是预后不良的独立危险因素。三结论1.急性期血清尿酸是急性缺血性卒中的一种消耗性抗氧化剂,其血清水平与脑梗死体积相关,可作为早期评估非心源性缺血性卒中影像学病变严重程度的指标。2. UA≤259 μmol/L是短期预后不良的独立危险因素。急性期较低血清尿酸水平可能不利于非心源性缺血性卒中患者的短期预后,其机制有待于进一步研究。3.入院血清尿酸水平与入院病情严重程度和进展卒中没有相关性。第二部分GLUT-9基因启动子区单核苷酸多态性与非心源性缺血性卒中的相关性研究一研究对象和方法本研究对象均来源于广州医科大学附属第二医院2012年1月至2014年4月连续登记在库的缺血性卒中患者。非心源性缺血性卒中入选标准为：(1)按Kidwell分类诊断为“肯定脑卒中患者”;(2)根据缺血性脑卒中TOAST分类标准诊断为LAA和SAA型脑卒中。排除标准：(1)短暂性脑缺血发作、脑出血、脑肿瘤、脑外伤：(2)有严重肾脏和肝脏疾病；(3)自身免疫性疾病史以及白血病、多发性骨髓瘤等明确肿瘤病史。根据出院时所评定mRS评分对患者进行分组,mRS评分0-2分为预后良好(预后良好组),mRS评分3-6分为预后不良(预后不良组)。所有患者均对本研究知情同意,并签署知情同意书。采用尿酸酶—过氧化物酶法检测患者血清尿酸。抽提患者外周血I)NA, PCR扩增GLUT-9基因启动子区片段,然后通过DNA测序,筛查获得GLUT-9基因启动子区SNP。利用在线分析软件BDGP:Neural Network Promoter Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)对GLUT-9基因5’-非翻译区转录起始位点上游序列中可能的核心启动子区进行预测。利用在线分析软件TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)预测GLUT-9基因启动子区SNP邻近序列(上、下游各10个碱基)潜在的转录因子结合位点,最低可信值(q)设为0.85。Hardy-Weinberg检验表明各SNP位点已达遗传平衡,确认所选样本具有群体代表性。采用SPSS 13.0统计学软件进行统计,血清尿酸水平和脑梗死体积为非正态分布计量资料,用中位数(Median, M)和四分位数间距(Inter quartile range, IQR)表示,不同基因型组间尿酸水平和脑梗死体积比较采用秩和检验。非心源性缺血性卒中患者预后良好组和预后不良组基因型分布用计数资料表示,组间比较采用Pearson χ2检验或者Fisher’s exact检验,按a=0.05的检验水准分析组间各指标之间是否有统计学意义。二结果1.非心源性缺血性卒中患者GLUT-9基因启动子区SNP位点筛查结果共对86例非心源性缺血性卒中患者进行了GLUT-9基因启动子区的基因筛查。将GLUT-9基因转录起始点上游约2 kb序列(-2030～+200)分成4个片段,依次命名为P1-P4。以患者外周血基因组DNA为模板进行PCR扩增得到各目的片段,对目的片段进行直接测序后进行比对分析。共筛查到11个SNP,命名为SNP1-SNP11,这些SNP位于-2030～-88区域,大部分集中在第一外显子附近。对86例非心源性缺血性卒中患者SNP1-SNP11基因分型结果与期望值进行Hardy-Weinberg平衡检测,p>0.05,说明观察值与期望值无显著性差异,与Hardy-Weinberg法则相符,有统计价值。2. GLUT-9基因核心启动子区及转录因子结合位点预测结果利用在线分析软件BDGP:Neural Network Promoter Prediction对GLUT-9基因5’-非翻译区转录起始位点上游约2 kb序列进行核心启动子预测。结果显示该序列存在核心启动子,可能的位置在反义链的-550到-503区。采用TFSEARCH在线分析工具预测了含SNP1-SNP11不同等位基因在内的邻近序列上潜在的转录因子结合位点,预测结果表明,GLUT-9基因启动子区的11个SNP位点邻近序列存在与SRY、HSF、SP1、deltaE和cap等重要转录因子相结合的位点。部分SNP变异可造成转录因子结合位点明显变化。其中,含SNP1、2、3、4、5、6、9、10野生型和变异型等位基因序列存在不同转录因子结合位点；含SNP7、8不同等位基因序列均不存在转录因子结合位点：而SNP11不同等位基因的同一序列存在相同的转录因子结合位点。3.GLUT-9基因启动子区SNP与非心源性缺血性卒中患者血清尿酸水平、脑梗死体积和预后的相关性为了检验次要变异基因影响血清尿酸水平和脑梗死体积的可能性,我们将具有变异等位基因杂合子和纯合子的对象进行合并,比较其与具有野生等位基因纯合子对象的血清尿酸水平和脑梗死体积。结果显示,各不同基因型间血清尿酸水平和脑梗死体积差异均无统计学意义(p>0.05)。86例非心源性缺血性卒中患者中,预后良好63例,预后不良23例。对预后良好组和预后不良组间11种SNP位点的基因型频率进行比较,结果显示预后良好组和预后不良组间11种SNP位点的基因型频率差异均无统计学意义(p>0.05)。三结论1.GLUT-9基因5’-非翻译区转录起始位点上游-550到-503区存在潜在的核心启动子。2. GLUT-9基因启动子区SNP位点基因型变异导致部分转录因子结合位点消失和新结合位点产生,GLUT-9基因启动子区SNP位点基因型变异可能对GLUT-9基因表达调控有显著影响。3. GLUT-9基因启动子区SNP位点基因型变异可能与非心源性缺血性卒中患者血清尿酸水平、脑梗死体积和预后无关。