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目的 白血病是一种常见的恶性肿瘤，在晚期常发生脑转移，转移率约为25～81％。因而脑转移成为白血病致死的主要原因之一。现有研究资料表明，白血病细胞是经血脑屏障而进入脑内，但其穿过血脑屏障的机制尚不清楚。阐明白血病细胞穿过血脑屏障的机制可望为防治其脑转移提供新的干预靶点。脑微血管内皮细胞（Human brain microvascular endothelial cell，HBMEC）及内皮细胞间的紧密连接（Tight junction，TJ）结构是构成血脑屏障（Blood brain barrier，BBB）的主要组成成分，紧密连接对调控血脑屏障的通透性起重要作用。 p160ROCK是一种丝／苏氨酸蛋白激酶，是Rho激酶家族的主要成员，对细胞骨架起调控作用。鉴于细胞骨架在紧密连接形成过程中的重要性，我们研究了p160ROCK在人早幼粒白血病细胞（HL-60）穿过血脑屏障中的作用。 方法 1．利用transwell建立由正常脑微血管内皮细胞构建的血脑屏障模型，常规方法计数在8h，16h，24h，32h和40h穿过血脑屏障模型的HL-60细胞数。 2．免疫荧光技术检测HL-60细胞与HBMEC相互作用后，HBMEC细胞骨架（罗丹明标记的毒伞素）和紧密连接（鼠抗ZO-1抗体，FITC标记的羊抗鼠抗体）的变化。 3．应用免疫荧光技术分析p160ROCK特异性抑制剂（Y-27632）对HBMEC细胞骨架和紧密连接结构，以及HL-60细胞穿过脑微血管内皮细胞单层的影响。 4．稳定表达p160ROCK dominant negative产物的HBMEC细胞株的构建 4．1 重组表达载体PCAG-myc-p160ROCK的构建。 4．2 XbaⅠ酶切鉴定含有p160ROCK dominant negative基因的质粒。 4.3应用脂质体转染法构建稳.定转染空载体PCAG和P160RocKdo而-nant negative的脑内皮细胞克隆株。 4.4免疫荧光技术鉴定转基因阳性克隆株（鼠抗my。抗体）。 4.5利用transweu建立转染空载体PCAG和转染p160RocKdo而nantnegative脑微血管内皮细胞构建的血脑屏障模型，常规方法计数在sh，16h，24h，32h和40h穿过各血脑屏障模型的HL一60细胞数。 4 .6免疫荧光技术观察转基因细胞的细胞骨架和紧密连接的变化。 5.Westem blot方法分析信号分子p16oRocK和AKT在调控细胞骨架与紧密连接结构之间的关系。结果 1.在8h，16h，24h，犯h和40h穿过由正常脑微血管内皮细胞构建的血脑屏障模型的HL一60细胞数随时间的增加而呈现逐渐升高的趋势。 2.HL一60与HBMEC作用24h后，经免疫荧光检测发现20一1由正常时连续的变为不连续的。提示HL一60细胞通过打开紧密连接进而穿过血脑屏障;细胞内张力纤维（Stress Fibe:r）与未经HL一60细胞作用的HBMEC相比数量增多，并由直线状变为锯齿状。 3.经p160“ocK特异性抑制剂Y一27632作用后，HL一60细胞穿过血脑屏障模型的数量显著高于正常对照组（未经Y一27632处理）。提示P160“ocK能调控血脑屏障的通透性。 Y一27632（10uM）作用HBMEC 30分钟后，经免疫荧光检测发现紧密连接结构蛋白20一1呈不连续点状表达，提示p160RocK促进紧密连接的形成;Y一27632（1 OuM）作用HBMEC30分钟后，仅在细胞周边可见聚合型肌动蛋白一F一。 ctin，细胞内部没有F一ac血出现，提示P160“ocK使细胞骨架重组。 4.稳定表达p一60“ocK do而nant，legative产物的HBMEC细胞株的构建 4.1重组表达载体PeAG一期;e一p160“ocK的构建。 4.2 Xb滋酶切鉴定含有p16o“ocK dominant negative基因的质粒，得到1291bp和6821bp两条带。 4.3应用免疫荧光技术筛选出含有pl60“ocK dominant negative基因的阳性克隆株。 4.4 HL一60细胞穿过由含有p:160“ocK dominant negative HBMEe构建的血脑屏障模型数量高于对照组（转染空载体PcAG组），提示p160Ro以的去活化能增强血脑屏障的通透性。 4 .5应用免疫荧光技术观察到转染pl60RoCKdo而nant negative细胞的张力纤维变细甚至消失;转染p16ORocK dominantnesative细胞的紧密连接结构蛋白20一1呈不连续表达，进一步说明p160ROCK能使细胞骨架重组并调控紧密连接结构形成。 5.westem blot分析显示，转染pl.6ORocK野生型细胞的P一AKT水平明显低于转染pl60“oCKdorninant negativ月。和PCAG空载体细胞，提示AKT与p160RoCK功能相反，AKT有使紧密连接开通的功能。结论 1.人早幼粒白血病细胞穿过脑微血管内皮细胞单层需要p160“ocK激酶的去活化。 2.p160RoCK激酶能够负性调节AKT激酶的活性;pl60“ocK激酶和AKT激酶协同调控脑微血管内皮细胞的细’胞骨架及内皮细胞间的紧密连接结构形成。