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第一部分视神经不全损伤后重组人睫状神经营养因子保护效应的研究目的研究重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)不同给药途径对猫视神经不全损伤后的神经保护效应。方法完成猫视神经不全损伤模型的制作；实验组分别给予rhCNTF静脉、前房、玻璃体内注射，对照组给予生理盐水；术后15天双侧上丘、外侧膝状体显微注射DiI逆行神经示踪；不同时间点行视觉诱发电位(P-VEP)检测；术后30天原位心脏灌注；视网膜铺片，视网膜神经节细胞计数；取术侧视神经组织，光镜和电镜观察各组视神经形态变化；视神经完成GAP-43免疫组织化学染色。结果对照组术侧眼P-VEP P-100较实验各组振幅明显减低，潜伏期明显延长，差异显著(P＜0．01)；与对照组相较，实验组视网膜神经节细胞存活数明显增加(P＜0．01)，神经结构更加完整。结论视神经不全损伤后rhCNTF不同途径给药均具有视神经保护效应，但效应存在差异，以玻璃体注射疗效最佳。第二部分重组人睫状神经营养因子联合坐骨神经移植促进视神经损伤后轴突再生的实验研究目的探讨重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)联合坐骨神经移植对猫视神经不全损伤后的神经保护效应。方法完成猫视神经不全损伤模型，并行视网膜坐骨神经移植；CNTF组给予rhCNTF玻璃体内注射，空白对照组给予生理盐水；术后15天双侧上丘、外侧膝状体显微注射DiI逆行神经示踪，坐骨神经残端Fluoro-Gold逆行神经示踪；不同时间点行视觉诱发电位(P-VEP)检测；术后30天原位心脏灌注；视网膜铺片，视网膜神经节细胞计数；取术侧视神经组织，光镜和电镜观察各组视神经形态变化；视神经完成GAP-43免疫组织化学染色。结果空白对照组术侧眼P-VEP P-100较CNTF组振幅明显减低，潜伏期明显延长，差异显著(P＜0．01)；与空白对照组相较，CNTF组视网膜神经节细胞存活数明显增加(P＜0．01)，神经结构更加完整。结论视神经不全损伤后CNTF联合坐骨神经移植具有协同视神经保护效应。第三部分绿色荧光蛋白、超顺磁氧化铁纳米粒子双标CNTF基因修饰神经干细胞的研究目的1．完成胚胎大鼠神经干细胞分离、培养、传代及鉴定；2．构建睫状神经营养因子(CNTF)基因真核表达载体并观察其在COS-7细胞内的表达；3．建立超顺磁氧化铁(SPIO)、绿色荧光蛋白(EGFP)双标睫状神经营养因子(CNTF)基因修饰神经干细胞(NSCs)。方法1．显微解剖分离E14d胚胎大鼠脑组织，用机械吹打法制成单细胞悬液，接种于含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)及N2的DMEM／F12(1：1)无血清培养基中培养，克隆球形成后进行传代培养。取第三代培养的细胞分别进行Nestin免疫细胞化学鉴定和诱导分化后GFAP、CNPase、β-Ⅲ-tubulin免疫细胞化学鉴定。2．应用RT-PCR从U-251细胞总RNA中扩增出CNTF CDS，将其克隆至真核表达载体pEGFPN1构建重组质粒pEGFPN1-CNTF，经酶切鉴定及序列分析后，转染COS-7细胞，应用免疫细胞化学、RT-PCR和western blot鉴定CNTF在细胞内的表达。3．重组质粒pEGFPN1-CNTF采用核转染技术转入大鼠胚胎神经干细胞，G418筛选建立CNTF基因修饰神经干细胞，SPIO标记细胞。应用免疫细胞化学、RT-PCR和western blot鉴定CNTF在基因修饰NSCs中的表达；普鲁士蓝染色、透射电镜鉴定SPIO标记率；诱导分化后免疫细胞化学鉴定其分化能力。结果1．E14d胚胎大鼠脑组织细胞培养72h后可形成悬浮生长的神经球，6-7d后即可传代；经传代扩增后得到大量同源的Nestin免疫阳性的细胞克隆球，经诱导分化后细胞呈GFAP、CNPase和β-Ⅲ-tubulin免疫阳性。2．RT-PCR产物为622bp的特异片段，重组质粒pEGFPN1-CNTF经双酶切产生618bp和4．7kb的片段，测序分析结果与文献报道结果一致，其转染COS-7细胞后，免疫细胞化学、RT-PCR和westernblot结果表明CNTF蛋白能在COS-7细胞中正确表达。3．重组质粒pEGFPN1-CNTF转染NSCs12h后EGFP开始表达；免疫细胞化学、RT-PCR和western blot表明CNTF能正确表达；普鲁士蓝染色示标记细胞内可见大量蓝染颗粒，透射电镜示SPIO颗粒位于吞饮小泡和胞浆内；体外诱导分化研究表明SPIO、EGFP双标记不影响其分化。结论成功建立了CNTF真核表达质粒pEGFPN1-CNTF和SPIO、EGFP双标CNTF基因修饰神经干细胞。第四部分睫状神经营养因子基因修饰神经干细胞移植治疗视神经损伤的实验研究目的探讨睫状神经营养因子(CNTF)基因修饰神经干细胞联合坐骨神经移植对猫视神经不全损伤后的神经保护效应。方法完成猫视神经不全损伤模型，并行视网膜坐骨神经移植；联合移植组给予CNTF基因修饰神经干细胞玻璃体内注射，神经移植组给予rhCNTF玻璃体内注射；术后165天双侧上丘、外侧膝状体显微注射DiI逆行神经示踪，坐骨神经残端Fluoro-Gold逆行神经示踪；不同时间点行视觉诱发电位(P-VEP)检测；术后180天原位心脏灌注；视网膜铺片，视网膜神经节细胞计数；取术侧视神经组织，光镜和电镜观察各组视神经形态变化；视神经完成GAP-43免疫组织化学染色。结果神经移植组术侧眼P-VEP P-100较联合移植组振幅明显减低，潜伏期明显延长，差异显著(P＜0．01)；与神经移植组相较，联合移植组视网膜神经节细胞存活数明显增加(P＜0．01)，神经结构更加完整。结论视神经不全损伤后CNTF基因修饰神经干细胞联合坐骨神经移植具有协同视神经保护效应。