研究背景与目的随着城市化、工业化、及全球化进程的加速,生态环境恶化、人类生活方式的改变、以及基因和遗传等因素的影响,全球肿瘤的发病率和死亡率均呈现逐年上升趋势。据世界卫生组织统计,2015年全球新增癌症病例约1750万例,并造成了870万人死亡,其中约67%的肿瘤发生在发展中国家。在我国,2015年新增癌症病例430万,位居世界首位;癌症死亡人数超过280万,占全球癌症死亡总人数的32%。其中,肺癌的发病率和死亡率均列居第一位。恶性肿瘤已成为严重威胁人类生命安全和社会发展的重大公共卫生问题,而肺癌也成为肿瘤防治的重中之重。临床上,依据组织学特征,把肺癌分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）,NSCLC包括鳞癌、腺癌和大细胞癌,约占肺癌总量的80-85%。近年来随着手术方式的改进、靶向药物的研发与应用、Check point抑制剂的问世,为肿瘤患者长期生存带来曙光;然而,肿瘤诊断时偏晚、肿瘤的耐药性、肿瘤的复发,仍严重困扰着患者的生存,总体NSCLC患者的5年生存率也不到20%。因此,探究肿瘤发病机制,寻找灵敏且高效的肺癌早期诊断标记物,以及耐药监测、预后评价指标等成为当下肺癌研究的热点。现有研究表明,基因表达的紊乱及表达产物的异常是肺癌发生、恶化及转移的内在因素和分子基础。早期关于肺癌的基础研究,大多是集中在编码蛋白基因在肺癌转化过程中的作用机制。然而,随着全基因组测序技术的发展,研究发现,只有不到3%的人类基因序列编码蛋白质,而87.3%的人类基因被转录成为RNA^[1],由于这些RNA不能编码蛋白质,因此被称为非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）。ncRNA根据转录本长度,被划分为:长度少于200bp的非编码性小RNA和长度介于200bp至100kb间的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）。随着研究的深入,人们逐渐认识到这些非编码RNA,参与了真核生物转录、转录后加工、表观遗传调控等多种途径的基因调控,具有非常重要的生物学功能。近年来研究发现,lncRNAs在肺癌发生发展,以及早期转移中发挥着重要的调控作用,甚至与肺癌患者预后、化疗及靶向药物耐药也有着千丝万缕的联系。因此,探究lncRNAs在非小细胞肺癌发生发展中主要调控机制,将为肺癌防治提供新靶点和新途径。为了探究长链非编码RNA在非小细胞肺癌发生和恶化中的作用,本研究收集临床非小细胞肺癌患者的癌组织样本和癌旁样本,RNA-seq进行分析,筛选在肺癌组织和癌旁组织中有差异表达的lncRNAs。结果显示,lncRNA BCYRN1（Brain Cytoplasmic RNA1）在癌组织中表达显著上调,鉴于此,我们选择lncRNA BCYRN1为课题研究的切入点,进行后续研究。通过检测不同类型的非小细胞肺癌患者其肿瘤及瘤旁组织中BCYRN1的表达,记录患者临床特征,观察BCYRN1的表达量与肿瘤大小、病理类型、临床分期等临床特征的关联;其次,通过BCYRN1-siRNA敲降非小细胞肺癌细胞和人类正常支气管上皮细胞中内源的BCYRN1,检测细胞增殖、迁移、凋亡情况。最后,检测BCYRN1敲降或过表达对Wnt信号通路活性的影响。方法1、肺癌组织样本收集:选取2016年1月至2017年1月期间,江西省肿瘤医院行肺癌根治术的手术病例,收集手术切除的肺癌原发病灶癌组织及癌旁组织标本（癌旁组织为距离肿瘤组织边缘>5cm）,筛选出术后病理证实为非小细胞肺癌（包括肺腺癌、鳞癌、大细胞癌、腺鳞癌）,且术前无化疗、放疗、免疫治疗、靶向治疗病史患者共60例。同时记录患者的临床基本信息、术后病理资料。所有标本的获取及操作均符合临床实验的伦理规范及南昌大学操作规程。2、细胞系及培养:从ATCC细胞库购买人类NSCLC细胞系A549、SPC-A1、H460、H1650,和人类正常的支气管上皮细胞系16HBE。使用含有10%胎牛血清（Hyclone,USA）的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA）或RPMI1640培养基（GIBCO-BRL,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA）进行培养,置于37℃,5%CO₂,饱和湿度的恒温培养箱中。3、总RNA提取及qRT-PCR分析:用Trizol裂解病人组织,提取总RNA,并通过荧光实时定量PCR检测患者肿瘤组织及癌旁组织中BCYRN1的表达水平,以及各细胞株中的BCYRN1的表达水平。4、siRNA瞬时转染:购买中国上海生物科技公司的BCYRN 1特异性si RNA和阴性对照siRNA。采用Lipo2000试剂（Invitrogen）转染非小细胞肺癌细胞系。转染后48hrs,收细胞,提取RNA,进行qRT-PCR分析。5、细胞增殖能力检测:将细胞接种于96孔板上,对细胞进行特定的干预（转染siRNA）,转染后6hrs、12hrs、24hrs、48hrs和72hrs,用CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂盒检测细胞増殖能力。在酶联免疫仪上选择450nm波长测定各组样品吸光值,绘制生长曲线,观察细胞增殖情况,并计算出细胞增殖率。6、体外侵袭实验:转染24hrs后,用胰蛋白酶消化并制成细胞悬液,接种于Transwell小室中;小室下层用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基填充600μL。在37℃下孵育48hrs后,用0.5%结晶紫溶液对迁移的细胞进行染色。每孔随机视野200×放大显微镜下计数细胞数,测定细胞数。7、细胞凋亡检测:将适量细胞接种于6孔板,培养24hrs后转染特定的siRNA。转染48hrs后收集细胞,洗涤、固定、透化,加入荧光（SA-FLOUS）溶液孵育,对细胞染色,应用流式细胞仪检测细胞的调亡情况。8、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的检测:细胞转染48hrs后收集细胞,裂解,提取细胞总蛋白,进行Wnt信号通路相关蛋白含量检测,如β-Catenin,及其靶蛋白c-Myc和Cyclin D1的表达。9、统计分析:采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析,两组间计数资料的比较采用卡方检验分析,计量资料的比较采用独立样本t检验,P<0.05表示有统计学差异。结果1、NSCLC患者肿瘤及癌旁组织BCYRN1表达情况:共检测60例NSCLC患者癌组织及其配对癌旁组织中BCYRN1的表达,两组水平分别为11.803±2.145、2.375±0.341,差异有统计学意义（P=0.031）。2、BCYRN1表达与肺癌临床病理特征的关系:以BCYRN1相对表达水平（癌组织/癌旁组织）中位数2.85为界,分为高表达组（≥2.85,n=27）与低表达组（<2.85,n=33）。通过比较发现,BCYRN1高表达与患者的年龄、性别、病理学类型、吸烟状态及肿瘤大小不相关（P>0.05）,与组织学分级（P=0.002）、淋巴结分期（P=0.013）、临床分期（P=0.025）、有无脉管侵犯（P=0.006）相关。3、BCYRN1在不同细胞系的表达水平:与正常人支气管上皮细胞系（16HBE）相比,四种肺癌细胞系（A549、SPC-A1,H460和H1650）中BCYRN1的表达水平均明显高于对照组,分别是16HBE的8.56倍,7.84倍,5.79倍,和9.43倍,差异有统计学意义（P<0.05）。4、BCYRN1-si RNA转染后各细胞系BCYRN1的表达水平:与未转染的细胞相比,BCYRN1-siRNA转染后,各细胞系BCYRN1的相对表达水平均明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。5、BCYRN1对细胞增殖的影响:通过细胞进行转染,阳性及阴性对照,分别于转染后6hrs、12hrs、24hrs、48hrs和72hrs进行CCK-8检测,其结果显示,在非小细胞肺癌四个细胞系中,与转染siRNA-NC阴性对照相比,转染siRNA-BCYRN1的细胞系其细胞增殖能力均有不同程度的降低,差异均有统计学意义（P<0.05）,在转染12小时之后抑制愈发明显。6、BCYRN1对细胞侵袭能力的影响:Transwell侵袭实验结果显示,在非小细胞肺癌四个细胞中,与阴性对照组和空白组相比,转染特异性siRNA-BCYRN1的细胞侵袭数显著减少,差异均有统计学意义（P<0.05）。7、BCYRN1对细胞凋亡的影响:沉默BCYRN1基因后,四个细胞系（A549、SPC-A1,H460和H1650）的细胞凋亡数目均明显增加,差异均有统计学意义（P<0.05）。8、BCYRN1对Wnt/β-catenin信号通路的影响:下调BCYRN1表达后,各细胞系β-Catenin、c-Myc和Cyclin D1的表达均明显减弱,提示BCYRN1与Wnt/β-Catenin信号通路有关。结论1、BCYRN1在非小细胞肺癌组织中表达量显著上调,暗示着BCYRN1扮演着原癌基因的功能,与非小细胞肺癌的发生和恶化密切相关。2、BCYRN1的表达水平在年龄、性别、吸烟、病理类型、肿瘤直径上无统计学差异;而在肿瘤组织低分化、纵隔淋巴结转移、临床分期为Ⅲ期、以及脉管侵犯中BCYRN1显著高表达（p<0.05）。3、BCYRN1在A549、SPC-A1、H460、H1650细胞株中均为高表达,通过促进细胞增殖、侵袭,抑制细胞凋亡来调控肿瘤转化。4、BCYRN1通过正向调控Wnt/β-Catenin信号通路,使Wnt信号通路相关蛋白表达增加,参与NSCLC的发生发展。