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Myroilysin是M12家族中少有的来源于细菌的金属蛋白酶,它能够降解弹性蛋白,并且在胶原蛋白的溶胀过程中起到了重要的作用。本实验室从Myroides sp.CSLB8中分离了 一种约23 kDa的蛋白酶,该蛋白酶和已报道的myroilysin蛋白酶在蛋白序列上具有99%的一致性。为了明确Myroides sp.CSLB8中myroilysin的催化机制,我们对该蛋白酶的三维结构进行了研究。我们首先从CSLB8培养液中纯化得到了 myroilysin蛋白,随后对其进行了结晶条件的筛选,并获得了该蛋白的晶体,但是X射线衍射结果显示该晶体不具有衍射能力。尽管我们对myroilysin蛋白的结晶条件进行了优化,但一直没有获得具有衍射能力的晶体。我们首先将myroilysin成熟肽的基因在大肠杆菌中进行了异源表达,但未获得表达产物。因此,我们通过PCR的方法扩增了 myroilysin酶原(pro-myroilysin)的基因,并在大肠杆菌中成功表达及纯化得到了 pro-myroilysin蛋白,并利用甲基化处理的pro-myroilysin蛋白进行了结晶条件的筛选,最后在0.1 M Bis-Tris pH 6.5，40%(w/v)PEG 4000 和 0.1 M HEPES-NaOH pH7.5，1.4 M sodium citrate 条件中获得了pro-myroilysin蛋白晶体。由于myroilysin是M12家族中依赖于锌离子的金属蛋白酶,因此我们在1.2816 A波长条件下收集了锌原子吸收峰的数据,解决pro-myroilysin蛋白晶体结构解析中的相位问题,并利用单波长反常散射法解析了来源于0.1 M HEPES-NaOH pH7.5,1.4 M 柠檬酸钠的 1.89 A 的 pro-myroilysin 晶体结构。我们还收集了 来源于 0.1 M Bis-Tris pH 6.5,40%(w/v)PEG 4000 条件的 pro-myroilysin 蛋白晶体的1.6 A的衍射数据,并以1.89 A的pro-myroilysin结构作为模板,利用分子置换的方法解析了 1.6 A的pro-myroilysin蛋白晶体的结构。来源于 0.1 M Bis-Tris pH 6.5，40%(w/v)PEG 4000 结晶条件的 pro-myroilysin蛋白晶体的空间群为P1211,每个不对称单元中只有一个pro-myroilysin蛋白的单体分子。整个蛋白分子由前体肽,氮端结构域和碳端结构域这三个部分组成,其中氮端结构域和碳端结构域形成一个V形的裂缝。Pro-myroilysin蛋白中His142、His146和His152这三个组氦酸残基侧链的NE2原子以及Cys28残基侧链的SG原子分别与活性中心的锌离子相结合,形成了 一个三角锥的形状。Pro-myroilysin蛋白活性中心附近α6螺旋中His142、Glu143和His146残基的侧链都指向了活性中心,α6螺旋的碳端一直延伸到Gly149,并且在第149位甘氨酸残基(Gly149)处形成链的转角,这引起第三个锌配体His52残基的构象发生变化并导致其侧链指向活性中心。Pro-myroilysin蛋白的Cys28残基和活性中心的催化性锌离子相结合,并且和催化性的Glu143残基形成了一个氩键。前体肽中Cys28残基的存在让催化性水分子无法进入活性中心,从而导致pro-myroilysin丧失了蛋白酶的活性。