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嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,简称A. caldus)为革兰氏阴性菌,是一种专性自养硫氧化细菌,最适pH为1.5-2.5,最适温度为40-50℃,能氧化无机还原性硫化合物获得生长所必需的能量和还原力,以卡尔文循环固定空气中的CO2作为碳源。A. caldus在生物冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等方面发挥重要作用。但是,A. caldus生长缓慢,代时长,细胞得率低,影响其浸矿效率,因此,对A.caldus的生长代谢进行深入研究以及利用分子生物学手段改造A.caldus,是该领域当前的重要课题。由于自养微生物生长缓慢和遗传操作困难,目前国际上对A.caldus遗传操作体系的研究比较缓慢,虽然已经建立了成熟的基因转移方法,但较为复杂,并且基因无痕敲除方法尚无报道。A. caldus的基因组测序已经完成,生物信息学分析发现A.caldus中与硫代谢相关的基因包括两处不完整的Sox硫氧化基因簇soxX-soxY-soxZ-soxA-hyp-soxB (sox clusterⅠ)和soxY-soxZ-soxB-hyp-resB-soxX-soxA-resC (sox clusterⅡ),以及非Sox硫氧化基因sqr, doxD, tth, hdr, sor等,也包括末端氧化酶和NADH醌氧化还原酶。各个硫氧化基因的功能是什么,以及如何在A.caldus中协调作用、共同氧化无机硫化合物,仍然在探索中。本论文首先在A. caldus中建立了基于细菌自身Rec同源重组和利用I-SceⅠ大范围核酸内切酶的"in-out"基因无痕敲除方法,构建了自杀型质粒载体pSDUDⅠ和I-SceⅠ酶的表达质粒pSDU1-I-SceⅠ,并成功敲除Sox clusterⅡ中硫氧化代谢基因soxYZ(ORF2520-2521),筛选效率为7%,在国际上首次成功建立了A.caldus基因无痕敲除方法,为深入研究A.caldus基因功能和分子生物学改造A.caldus奠定了基础。然后测定了A. caldus野生株和soxYZ(ORF2520-2521)敲除株在以硫粉为能源和以连四硫酸钾为能源的生长过程中,OD600和氢离子浓度的变化,观察到以硫粉为硫源培养时,野生株和soxYZ(ORF2520-2521)敲除株的生长没有明显的区别,而以连四硫酸盐为硫源培养时,敲除株比野生株晚进入指数生长期且其生长明显弱于野生菌,与Mangold等的反转录PCR和凝胶蛋白质组定量分析结果相吻合,初步判断Sox clusterⅡ编码的Sox硫氧化系统是连四硫酸盐代谢中的重要蛋白。