一、研究背景组织创伤修复是整形外科研究领域的传统热点和难点,而该领域内的再生医学研究已成为近年来的整形外科的重点研究方向。再生医学的最终目的是使得受损的组织或器官修复再生。而机体损伤的修复与再生主要通过参与损伤修复的细胞去分化(Dedifferentiation)、转分化(Transdifferentiation)和重编程(Reprogramming)。人作为哺乳动物,仅具备有限的组织和器官再生能力,如肝脏和血液。而一些非哺乳动物则具有非凡的再生能力,如斑马鱼和蝾螈等。这些非哺乳动物的可再生组织在创伤发生后,受损区域的成体细胞发生去分化和增殖,参与组织的修复再生。通过对斑马鱼等经典的再生修复模型的研究,有学者提出组织再生的核心问题是新生组织的细胞来源,而参与再生的细胞主要来源于干细胞和去分化的成体细胞。以往再生医学领域的研究多集中于干细胞治疗研究上。既往有学者研究表明,虽然干细胞移植治疗能够促进创伤愈合,但干细胞的移植并未本质上改变创伤愈合的方式。干细胞移植治疗只是促进了愈合的过程,其移植的干细胞主要是通过分泌多种生长因子促进创伤愈合的,其自身分化为新生组织的比例很低。而斑马鱼心肌再生机制中所涉及的“成体细胞的去分化及增殖”机制逐渐引起了研究者的浓厚兴趣。在斑马鱼心肌局部受损后,成熟心肌细胞开始去分化,并重新进入细胞周期开始增殖,这一过程是斑马鱼心肌局部受损修复再生的基础。这种“成体细胞的去分化及增殖”的组织再生机制与人体周围神经受损后修复再生过程有相似之处,即损伤修复过程与受损组织的主要成分细胞去分化及增殖密切相关,即斑马鱼的心肌细胞和人体的施旺细胞(Schwann Cell)。施旺细胞是构成周围神经系统的主要神经胶质细胞。施旺细胞参与了多种十分重要的周围神经生物学功能：参与神经冲动传导,参与神经的生长和再生,并具有营养神经元,生产神经细胞外介质,调节运动神经活性以及介导抗原的作用。当周围神经损伤后,发生一系列细胞和分子生物学变性-华勒氏变性(Wallerian degeneration)。华勒氏变性过程中,施旺细胞的去分化为神经再生提供再生支架和神经营养因子,以及引导轴突延伸并维持神经元的活力,促进再生神经的结构和功能恢复,施旺细胞的去分化是周围神经再生的基础。因此,我们认为,对周神经系统损伤后施旺细胞去分化的干预因素及其作用机制展开深入研究对于促进再生医学的研究发展具有深远的意义。需要注意的是,本研究所讲华勒氏变性均是指外周神经系统华勒氏变性,这并不表示中枢神经系统不发生华勒氏变性。在中枢神经系统,虽然有与外周神经系统施旺细胞和巨噬细胞相对应的少突胶质细胞(oligodendrocyte)和小胶质细胞(microglia),在神经组织受损后也会发生华勒氏变性,只是中枢神经系统华勒氏变性的结果却完全不同。中枢神经系统华勒氏变性并不能像外周神经系统华勒氏变性那样清除髓鞘崩解的碎片,并不能形成组织损伤修复再生。在外周神经系统华勒变性过程中,单核/巨噬细胞激活并聚集于损伤区域,巨噬细胞分泌包括IL-1β在内的等多种炎症因子,并与施旺细胞共同参与清除髓鞘崩解的碎片,参与华勒变性,并影响神经再生的进程。并且,在单核/巨噬细胞激活并聚集于损伤区域之前,受损后的外周神经组织即开始高表达包括IL-1β在内的等多种炎症因子。研究表明,IL-1β可诱导单核巨噬细胞迁移至损伤部位参与髓鞘碎片的清除以利于神经再生。除了作用于单核巨噬细胞参与炎症反应以外,IL-1p还可通过直接或间接的途径促进神经元的存活。并且,IL-1β可增加神经受损区域施旺细胞NGF mRNA的表达量及NGF的蛋白分泌量,而NGF具有促进神经元存活及神经突生长的作用。既往有研究者通过IL-1p早期干预大鼠坐骨神经损伤模型,提示IL-1p通过促进损伤区域神经元存活和神经突生长,以促进外周神经再生。可见,IL-1p在外周神经损伤早期具有重要的作用。然而,上述研究并未涉及IL-1β对外周神经再生过程中施旺细胞去分化的影响。既往却有研究表明IL-1β通过c-Jun/AP-1通路促使软骨细胞去分化。既往研究发现,c-Jun于体内及体外实验中均可抑制施旺细胞髓鞘化,促使分化成熟施旺细胞发生去分化。在小鼠动物模型中,选择性敲除施旺细胞中的c-Jun基因,虽然不会影响外周神经系统的发育和生长,但会使外周神经丧失再生能力；致使华勒氏变性过程中施旺细胞的分子表型及Bungner’s带的结构异常,以及影响神经元的存活,轴索的再生等。小鼠脊髓损伤模型中,施旺细胞中c-Jun缺失会导致外周神经损伤后,神经元坏死量增多,以及神经胶质细胞源性的神经营养因子GDNF等神经营养因子表达降低。同时又有研究表明,c-Jun跟细胞凋亡的关系密切。采用显微注射特异性c-Jun抗体干扰其功能,或采用去除转录激活区保留DNA结合区的负显性c-Jun突变体阻断c-Jun的转录活性,这些降低c-Jun活性的干预均可有效地阻滞神经元凋亡的发生。并有研究认为c-Jun的转录活化是诱导神经元凋亡所必需。这些研究结果及观点虽有所不同,但仍然可以看到,c-Jun相关通路在周围神经再生及施旺细胞去分化、增殖、凋亡等方面具有十分关键的调控作用。既往文献提示我们华勒变性早期IL-1p在周围神经中表达升高,而此阶段又恰是施旺细胞去分化及增殖的重要时段,同时IL-1p在其他细胞模型的研究中又可通过c-Jun/AP-1通路促进成熟细胞去分化。由此,我们猜测IL-1p在外周神经损伤再生修复过程中对施旺细胞去分化、增殖及凋亡具有重要的调控作用,并且可能是通过c-Jun等相关通路发挥作用。既往研究外周神经损伤后华勒变性主要集中在体内模型中,体内模型中对华勒变性的影响因素众多,而单纯的体外培养施旺细胞原代,使得施旺细胞脱离了神经轴索对其的影响,也很难真实反映干预因素对外周神经系统中施旺细胞的影响。因此本研究应用外周神经华勒变性体外模型,该模型主要是参照Thomson et al.于1993报道的体外华勒氏变性模型(in-vitro Wallerian Degeneration model),模型中施旺细胞可表现出与体内华勒氏变性模型中相似的MPZ等髓鞘化相关基因表达降低,而p75NTR等非髓鞘化相关基因表达升高。该模型后经Lee, H. K. et al.采用并改进,应用于Proteasome抑制施旺细胞去分化的研究。以及Jung, J. et al.和Shin, Y. K. et al.采用,同样也是用于研究华勒氏变性过程中施旺细胞去分化的影响因素。由此,可见体外华勒氏变性模型具有较好可靠性。因此,我们采用该体外华勒氏变性模型,并根据需要做了改进,以研究IL-1p对施旺细胞的影响,重点关注华勒变性早期IL-1p对施旺细胞去分化、增殖及凋亡影响,并研究探讨相关的作用机制,希望以此为窗口来探寻局部组织损伤后炎症因子对成体细胞去分化及组织再生的影响。二、研究目的通过改进后的大鼠坐骨神经体外华勒氏变性模型,进一步确认该模型的可靠性,并以该模型为基础,研究外周神经系统华勒变性早期施旺细胞IL-1p的表达情况,以及IL-1p对施旺细胞去分化、增殖及凋亡影响,并研究探讨相关的作用机制,希望以此为窗口来探寻局部组织损伤后炎症因子对成体细胞去分化及组织再生的影响。三、研究方法1.体外华勒氏变性模型的制备及分组干预体外华勒氏变性模型的制备方法主要是参照Thomson et al.于1993报道的vitro Wallerian degeneration model制备方法,并根据我们的实验目标进行了改进。即将去除神经外膜的大鼠坐骨神经分成絮状神经丝后体外组织培养。离体后的坐骨神经组织即开始发生华勒氏变性,并且此模型中的主要细胞成分只有施旺细胞。实验中,根据实验目的不同,给予体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1p干预,并于不同时间点收集样本。2. Real time PCR测定体外华勒氏变性模型中不同时间点(6 H、12H、24H)施旺细胞IL-1β mRNA表达量。3. Elisa测定体外华勒氏变性模型中不同时间点(12H、24H、36H、48H)施旺细胞IL-1p蛋白的表达量。4.体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预(0ng/ml、5ng/ml和50ng/ml)48小时后,免疫荧光染色标记施旺细胞去分化指标p75NTR和分化指标MPZ,并且Western Blot分别检测并量化比较p75NTR和MPZ蛋白表达量。5.体外华勒氏变性模型中0 ng/ml(对照组)或5ng/ml IL-1β干预后,Real time PCR检测不同时间点(6 H、12 H、24 H)去分化指标p75NTR和分化指标MPZ mRNA表达量。6.体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预(0 ng/ml和5 ng/ml)24小时,免疫荧光染色标记施旺细胞转录因子c-Jun,并统计比较c-Jun阳性率；Western Blot检测进一步量化比较转录因子c-Jun表达量差异。7.体外华勒氏变性模型中0 ng/ml(对照组)或5ng/ml IL-1β干预后,Real time PCR检测不同时间点(6 H、12 H、24 H)转录因子c-Jun mRNA表达量。8.体外华勒氏变性模型中0 ng/ml(对照组)或5ng/ml IL-1β干预后,AP-1activity assay检测不同时间点(6 H、12 H、24H)核转录激活蛋白1(AP-1)的活性相对值。9.体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1p干预(0 ng/ml和5 ng/ml)48小时,免疫荧光染色标记施旺细胞增殖标记Ki67,并统计比较Ki67阳性率(即细胞增殖率)。10.体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预(0 ng/ml和5 ng/ml)48小时,Tunel法染色标记施旺细胞细胞凋亡情况,并统计各组Tunel阳性率(即细胞凋亡率)。11.体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1p干预(0ng/ml和5ng/ml)24小时,Western Blot检测细胞凋亡促进蛋白Bax和细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表达量,统计比较Bcl-2和Bax表达量以及Bcl-2/Bax比值。12.数据处理及统计学分析方法：实验所得计量资料数据以均数±标准差表示(mean±SD),每一实验重复三次(n=3)。采用SPSS16.0统计软件进行数据处理；两样本均数间比较用两独立样本t检验；多组样本均数间比较采用单因素方差分析(one-way ANOV A),如有显著性差异,且方差齐性,则采用LSD(Least Significant Difference)检验进行统计分析；p<0.05认为差异有统计学意义。四、结果1.体外华勒氏变性模型中施旺细胞IL-1βmRNA和IL-1p蛋白表达量变化去除神经外膜的大鼠坐骨神经组织离体后置于体外华勒氏变性模型中进行培养,于不同时间点收集样本。Real time PCR检测不同时间点(6H、12H、24H)施旺细胞IL-1βmRNA表达量检测结果采用单因素方差分析,F=24.384,p<0.001；Elisa检测不同时间点(12 H、24 H、36H、8H)施旺细胞IL-1β蛋白表达量,检测结果采用单因素方差分析,F=169.261,p<0.001；且方差齐性,随后LSD法检验不同时间点与对照组OH之间的表达差异,大鼠坐骨神经受损离体后华勒氏变性过程中施旺细胞IL-1βmRNA和IL-1β蛋白表达量逐渐增高,IL-1βmRNA于12小时较对照组升高了近7倍达到高峰期,随后开始有所降低；IL-1β蛋白分泌量逐渐增高,于36小时较对照组升高了近4倍达到高峰期,随后开始有所降低。2.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中p75NTR和MPZ表达情况给于体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预(0 ng/ml、5 ng/ml和50ng/ml)48小时,免疫荧光染色标记施旺细胞去分化指标p75NTR和分化指标MPZ。观察显示,5ng/ml IL-1β干预后施旺细胞去分化指标p75NTR表达量较0ng/ml组有所升高,施旺细胞分化指标MPZ表达量较0ng/ml组有所降低；而50ng/ml IL-1β干预后,p75NTR和MPZ表达量较0 ng/ml组差异并不显著；Western Blot检测量化比较不同浓度组p75NTR和MPZ表达量差异(单因素方差分析,p75NTR检测结果中F=9.620, p=0.013; MPZ检测结果中F=9.604,p=0.013；且统计显示方差齐性,随后LSD法检验不同浓度组与对照组0 ng/ml之间的表达差异),5 ng/ml浓度组较对照组0 ng/ml中p75NTR表达量显著升高(p=0.008),MPZ表达量显著降低(p=0.005)；50ng/ml浓度组较对照组0 ng/ml中p75NTR以及MPZ表达量差别无统计学意义。Western Blot检测与免疫荧光染色结果一致。3.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中p75NTR和MPZ mRNA表达情况予体外华勒氏变性模型中0 ng/ml(对照组)或5ng/ml IL-1β干预后,于不同时间点(6H、12H、24H)收集样本, Real time PCR检测p75NTR和MPZ mRNA表达量,检测所得结果采用两样本Student t检验统计不同时间点内5 ng/ml干预组与对照组之间p75NTR和MPZ mRNA表达量的差异,检测结果显示p75NTR mRNA表达量随着时间推移逐渐升高,5 ng/ml干预组p75NTR mRNA表达量较对照组显著升高,干预6小时后干预组p75NTR mRNA表达量较对照组升高了近5倍(t=-17.642,p<0.001),干预12H和24H后,5ng/ml IL-1β干预组p75NTR mRNA表达量较对照组均升高了近2.5倍(两组t值分别为-8.578和-9.053,p<0.001); MPZ mRNA表达量随着时间推移逐渐降低,5 ng/ml干预组MPZmRNA表达量较对照组显著降低。干预后的三个时间点(6H、12H、24H)5ng/mlIL-1β干预组MZP mRNA表达量较对照组降低约50%(6H VS OH, t=6.416, p=0.003<0.01; 12H VS OH,t=5.556,p=0.005<0.01;24H VS OH,t=7.913,p<0.001), Real time PCR检测结果显示,IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中施旺细胞p75NTR mRNA表达量显著升高,而MPZ mRNA表达量显著降低。4.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中转录因子c-Jun表达情况给于体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预(0 ng/ml和5 ng/ml)24小时,免疫荧光染色标记施旺细胞转录因子c-Jun,观察可见转录因子c-Jun均主要位于细胞核内,即均处于其功能部位,5 ng/ml干预组转录因子c-Jun表达量较0 ng/ml组有所升高；量化比较两组之间施旺细胞的细胞核内转录因子c-Jun阳性率,5 ng/ml干预组转录因子c-Jun阳性率较0 ng/ml组显著升高(t=-3.868,p=0.018)。Western Blot检测进一步量化比较IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中转录因子c-Jun表达量差异,分析显示5 ng/ml干预组转录因子c-Jun蛋白表达量较0 ng/ml组显著升高(t=-4.508,p=0.011)。Western Blot检测与免疫荧光染色结果一致,证实了,适当浓度(5 ng/ml) IL-1β可促进坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞细胞核内转录因子c-Jun表达。5.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中c-Jun mRNA表达情况予体外华勒氏变性模型中0 ng/ml(对照组)或5 ng/ml IL-1β干预后,于不同时间点(6 H、12 H、24 H)收集样本,Real time PCR检测IL-1p干预后体外华勒氏变性模型中c-Jun mRNA表达量。统计分析于不同时间点(6 H、12 H、24 H)内5ng/ml IL-1β干预组与对照组之间c-Jun mRNA表达量的差异。结果显示,去除神经外膜的坐骨神经离体后于体外华勒氏变性模型中c-Jun mRNA表达量随着时间推移逐渐升高,5 ng/ml干预组较对照组显著升高,干预6小时后,5ng/ml IL-1β干预组c-Jun mRNA表达量较对照组升高约150%,且统计差异显著(t=-8.733,p<0.001)；干预12小时和24小时后,5ng/ml IL-1β干预组c-Jun mRNA表达量较对照组均升高约50%,且统计差异显著(12小时组t=-3.498,p=0.025；24小时组t=-3.716,p=0.022). Real time PCR基因水平检测结果与Western Blot、免疫荧光染色的蛋白水平检测结果一致。可见,适当浓度(5 ng/ml) IL-1β可促进坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞细胞核内转录因子c-Jun表达。6.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中AP-1的活性变化情况予体外华勒氏变性模型中0 ng/ml(对照组)或5ng/ml IL-1β干预后,于不同时间点(6 H、12 H、24 H)收集样本,AP-1 activity assay检测IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中核转录激活蛋白1 (activation pmtein, AP-1)的活性相对值。检测所得结果采用两样本Student t检验,统计分析于不同时间点(6 H、12 H、24 H)内5 ng/ml IL-1β干预组与对照组之间AP-1活性差异。结果显示,去除神经外膜的坐骨神经离体后于体外华勒氏变性模型中AP-1的活性随着时间推移逐渐升高,5 ng/ml干预组较对照组升高更加显著,干预6小时后,5 ng/ml IL-1β干预组AP-1的活性较对照组升高约20%,然而统计差异并不显著(t=-1.359,p=0.246)；干预12小时后,5 ng/ml IL-1β干预组AP-1的活性较对照组升高约50%,统计差异显著(t=-4.529,p=0.011)；干预24小时后,5 ng/ml IL-1β干预组AP-1的活性较对照组升高约80%,统计差异显著(t=-3.952,p=0.017)。可见,适当浓度(5 ng/ml) IL-1β不仅促进坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞细胞核内转录因子c-Jun表达,而且增加华勒氏变性过程中施旺细胞AP-1的活性。7.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中细胞增殖标记Ki67表达情况给于体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预(0 ng/ml和5 ng/ml)48小时,免疫荧光染色标记施旺细胞增殖标记Ki67,观察可见Ki67均主要位于细胞核内,且5 ng/ml干预组Ki67表达量较0 ng/ml组有所升高；量化比较两组之间施旺细胞的细胞核内Ki67阳性率,5 ng/ml干预组Ki67阳性率较0 ng/ml组显著升高(t=-6.264,p=0.003)。免疫荧光染色显示,适当浓度(5 ng/ml) IL-1β可促进坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞的增殖。8.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中细胞凋亡情况给于体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预(0 ng/ml和5 ng/ml)’48小时,Tunel法染色标记施旺细胞细胞凋亡情况,并统计各组Tunel阳性率(即细胞凋亡率)的差异,显示5 ng/ml干预组凋亡率较0 ng/ml组显著降低(t=4.274,p=0.013)。Tunel法细胞凋亡检测显示,适当浓度(5 ng/ml) IL-1β可抑制坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞的凋亡。9.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中Bax和Bcl-2表达情况给于体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预(0 ng/ml和5 ng/ml)24小时,Western Blot检测细胞凋亡促进蛋白Bax和细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表达量,显示5 ng/ml浓度组较对照组0 ng/ml中施旺细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2表达量显著升高(t=-3.456,p=0.026),凋亡促进蛋白Bax表达量显著降低(t=3.052,p=0.038),且Bcl-2/Bax蛋白表达量比例显著升高(t=-4.397,p=0.012)。这与Tunel法凋亡细胞染色结果一致。可见,适当浓度(5 ng/ml) IL-1β可增加凋亡抑制蛋白Bcl-2表达量,降低凋亡促进蛋白Bax表达量,从而抑制坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞凋亡。五、结论本实验研究显示,体外华勒氏变性模型是研究周围神经系统华勒氏变性过程中干预施旺细胞去分化影响因素的有效模型。通过该模型,我们研究进一步证实华勒氏变性早期施旺细胞IL-1β mRNA表达量升高,IL-1β蛋白分泌量增多,华勒氏变性可视为外周神经系统应对神经损伤的固有免疫反应。通过该模型给予相应干预,我们研究发现适当浓度的IL-1β具有促进华勒氏变性过程中施旺细胞去分化的作用,以及促进华勒氏变性过程中施旺细胞清除髓鞘碎片,从而促进周围神经再生,而过高浓度的IL-1β对华勒氏变性过程中施旺细胞去分化以及髓鞘碎片的清除并无促进作用。本研究证实华勒氏变性早期适当浓度的IL-1β具有促进施旺细胞转录因子c-Jun mRNA表达量,以及促进施旺细胞的细胞核内转录因子c-Jun的高表达,并促进施旺细胞内AP-1活化；并认为华勒氏变性早期IL-1β通过c-Jun/AP-1通路促进施旺细胞去分化,以及促进施旺细胞清除髓鞘碎片,从而促进周围神经再生。本研究证实华勒氏变性早期适当浓度的IL-1β具有促进施旺细胞增殖,以及增加Bcl-2表达量,减低Bax表达量,升高Bcl-2/Bax比值,抑制施旺细胞凋亡的积极作用；并认为IL-1β通过促进c-Jun/AP-1通路活化促进施旺细胞增殖,通过Bcl-2/Bax通路抑制施旺细胞凋亡。