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研究目的探究芹黄素在OSCC细胞中的生物学作用,并探索其作用的分子机制。材料和方法分别使用浓度为0μM,20μM,40μM,60μM,80μM,100μM芹黄素处理OSCC细胞系Cal-27和UM-SCC6,MTT检测细胞活性。集落形成实验分析细胞增殖,计数细胞集落的数量。流式细胞仪测定细胞周期分布。使用Hoechst 33342染色和流式细胞仪分析芹黄素对Cal-27和UM-SCC6的促凋亡作用。细胞成球实验评估芹黄素对OSCC干细胞的影响,并用流式细胞术检测ALDH1活性细胞所占比例。接下来我们使用UM-SCC6细胞系建立OSCC异种移植小鼠模型来研究芹黄素对OSCC细胞体内肿瘤发生的影响。同时通过RNA测序分析调查了长链非编码RNA（Long chain noncoding RNA,Lnc RNA）谱,并用q-RT-PCR进行验证并选择LINC00629-002来做后续的功能性,分别使用浓度为0μM,20μM,40μM,60μM的芹黄素处理UM-SCC6和Cal-27细胞,用q-RT-PCR分析LINC00629的表达水平。我们对UM-SCC6细胞用芹黄素处理或进行敲低LINC00629处理,分析细胞活性和凋亡情况。并通过ALDHI阳性分类检测去测定LINC00629对OSCC干细胞的作用。基于LINC00629在芹黄素的抗癌效果中发挥着重要的作用,我们继续探究其下游蛋白质。确定目标蛋白髓样细胞白血病蛋白1（Myeloid leukemia protein 1,Mcl1）后,采用免疫印迹实验检测Mcl1蛋白质水平。为了进一步证实LINC00629是否促进芹黄素诱导的Mcl1减少,UM-SCC6和Cal-27细胞中进行40μM芹黄素处理或INC00629敲低,之后用免疫印迹实验检测Mcl1蛋白质水平,检测芹黄素和LINC00629对Mcl1的影响。为了证实LINC00629是否以蛋白酶体依赖的方式影响Mcl1表达,我们首先检测了LINC00629对在芹黄素处理下的Mcl1稳定性的影响。在正常或LINC00629敲低的UM-SCC6细胞中检测10μM CHX对Mcl1蛋白质水平的影响。然后把HA-Ub转染到正常或LINC00629敲低的UM-SCC6和Cal-27细胞。全细胞裂解物用Mcl1抗体进行免疫沉淀并且用抗Ub抗体的免疫印迹法去检测泛素化Mcl1。为此,我们做了RNA免疫沉淀实验及RNA下拉实验来探寻LINC00629是否可以和Mcl1相互作用。为了检测Mcl1在LINC00629上相互作用的主要区域,我们还进行了缺失定位实验。研究结果1.芹黄素抑制OSCC细胞增殖和促进细胞凋亡芹黄素以剂量依赖的方式显著降低细胞活力并抑制OSCC细胞的增殖。通过流式细胞仪分析,我们发现用芹黄素处理可导致细胞周期在G2/M期受阻,同时Cal-27和UM-SCC6细胞在G1期分布的细胞数量减少（p＜0.001）。然后,我们使用Hoechst 33342染色和流式细胞仪分析了芹黄素对Cal-27和UM-SCC6细胞的促凋亡作用。数据表明,芹黄素处理后,凋亡细胞的数量以浓度依赖的方式明显增多,结果具有统计学意义（p＜0.001）。2.芹黄素抑制OSCC干细胞特性和体内的肿瘤形成细胞成球实验显示,在芹黄素处理后成球效率急剧下降（p＜0.001）。流式细胞仪测量ALDH1活性细胞所占比例并且发现芹黄素处理后ALDH1活性比例显著降低（p＜0.001）。除此之外,我们也检测了在OSCC细胞中干性标记物Oct4,Nanog和CD133的表达。与对照组相比,芹黄素处理后Oct4,Nanog和CD133的表达显著降低,芹黄素在OSCC细胞中上调LINC00629的表达,结果具有统计学意义（p＜0.001）。通过UM-SCC6细胞系建立OSCC异种移植小鼠模型,我们发现与对照盐水组相比,芹黄素处理组的肿瘤体积和重量都明显减少（p＜0.01）。随后通过免疫组织化学染色,结果发现芹黄素处理降低了Ki-67阳性细胞的比例,提高了Cleaved Caspase 3阳性细胞的比例。这部分结果提示芹黄素降低了OSCC干细胞的特质,抑制了体内肿瘤的形成。3.芹黄素在OSCC细胞中上调LINC00629的表达为了进一步揭示芹黄素的抗癌分子机制,使用40μM芹黄素处理UM-SCC6细胞。通过RNA测序分析调查了Lnc RNA谱,我们获得了1655个上调的和963下调的Lnc RNAs,并从中选出了8个候选基因。q-RT-PCR验证结果证实用芹黄素处理后LINC00629-002表达显著增多（p＜0.001）。因此,我们选择LINC00629-002来做后续的功能性研究,并把它命名为LINC00629。我们用不同浓度的芹黄素处理UM-SCC6和Cal-27细胞达36h,用q-RT-PCR分析LINC00629的表达水平。我们发现了LINC00629的表达随着芹黄素剂量的增加不断增加,并随着时间的延长LINC00629也随之上调,结果具有统计学意义（p＜0.001）。4.LINC00629促进芹黄素在OSCC细胞中的抗癌效果为了评估LINC00629在芹黄素诱导的肿瘤抑制中所起的生物学作用,我们对UM-SCC6细胞用芹黄素处理或进行敲低LINC0062处理,分析细胞活性和凋亡情况。结果发现敲低LINC00629表达使芹黄素诱导的细胞凋亡减少,结果具有统计学意义（p＜0.001）。在Cal-27细胞中也得到了相似的结果。此外,我们还进行了ALDH1阳性分类检测去测定LINC00629对OSCC干细胞的作用。结果表明,LINC00629的耗尽回复了芹黄素对OSCC干细胞的抑制作用,并且ALDH1阳性细胞的数量也随之减少（p＜0.01）。这部分结果提示LINC00629在芹黄素的抗癌作用中发挥了重要作用。5.LINC00629导致芹黄素诱导Mcl1下调接着,我们继续探寻LINC00629发挥作用的下游蛋白质。结果发现在UM-SCC6和Cal-27细胞中芹黄素抑制Mcl1的表达（p＜0.01）。同样,Mcl1过表达也抑制了UM-SCC6细胞中芹黄素诱导的细胞活性的降低和细胞凋亡的增加（p＜0.01）。基于上述研究结果,我们猜想LINC00629可能会导致芹黄素介导的Mcl1的下调。为此,我们首先检测了在LINC00629敲低和正常的OSCC细胞中Mcl1的表达水平。我们发现抑制LINC00629可以使Mcl1蛋白水平升高并且抑制芹黄素介导的Mcl1的下调。为了进一步验证LINC00629是否通过调节Mcl1促进芹黄素诱导细胞凋亡,我们把Mcl1转染到LINC00629过表达和正常的UM-SCC6细胞中并且通过流式细胞术分析细胞的凋亡。我们发现在LINC00629过表达的细胞中转染Mcl1可挽救LINC00629导致的细胞凋亡,结果具有统计学意义（p＜0.001）。这部分结果提示LINC00629促进了芹黄素对Mcl1的抑制,并通过调节Mcl1的水平增强了芹黄素的抗癌能力。6.LINC00629与Mcl1相互作用并且促进Mcl1下调为了证实LINC00629是否以蛋白酶体依赖的方式影响Mcl1表达,我们首先检测了LINC00629对在芹黄素处理下的Mcl1稳定性的影响。我们发现芹黄素降低了Mcl1的稳定。然而,抑制LINC00629表达可以逆转芹黄素导致的Mcl1稳定性降低,结果具有统计学意义（p＜0.001）。同样,LINC00629消耗使芹黄素诱导的Mcl1泛素化减少。我们做了RNA免疫沉淀实验,结果显示Ig G相关Mcl1抗体可以使LINC00629增加,并且芹黄素处理可使在Mcl1免疫沉淀实验中增加的LINC00629进一步增多。此外,我们还实施了RNA下拉实验,正如我们所料,Mcl1被LINC00629沉淀。为了检测Mcl1在LINC00629上相互作用的主要区域,我们还进行了缺失定位实验,我们观察到结合区域主要在1-202核苷酸序列。总之,这些数据均表明了LINC00629可以通过与Mcl1相互作用而加速其降解。结论芹黄素可抑制OSCC细胞的增殖并促进其凋亡,这一过程通过LINC00629与Mcl1轴相互作用并导致Mcl1在OSCC细胞中降解,从而抑制OSCC的进展。