自20世纪60年代以来,随着疯牛病的出现和传播,人们越来越重视牛脑组织的食用性安全,最新的文献检索表明健康牛脑组织中的神经节糖苷、饱和脂肪酸、髓磷脂碱蛋白、周围神经髓鞘、热休克蛋白HSP104及相关因子也可能给人类神经系统健康带来危害。为探讨健康牛脑组织成分危害哺乳动物神经系统健康及有关机理,完成牛脑组织食用的安全性评估。本试验将健康牛脑组织在模拟的胃肠环境中进行体外消化,获得含牛脑活性成分的提取物。同时制备含牛脑活性成分的饲料,然后利用哺乳动物小鼠活体模型,将120只BALB/c小鼠分为四个组,分别做以下处理：Ⅰ组小鼠饲喂添加牛脑组织的饲料；Ⅱ组小鼠饲喂添加牛脑组织的饲料,同时腹腔注射牛脑组织提取液；Ⅲ组小鼠饲喂普通饲料,同时腹腔注射空白消化液；Ⅳ组小鼠饲喂普通饲料。连续饲喂或／和注射后,分别在第30d、90d和150d开展以下研究：牛脑组织提取物对小鼠学习记忆能力的影响、小鼠朊蛋白基因的克隆表达以及朊蛋白糖基化水平的研究,查明牛脑提取物能否诱导哺乳动物的PRNP基因和PrPC蛋白在序列特征、糖基化修饰等方面产生有利于生成PrpSc的变化,结果如下：1.牛脑组织提取物对小鼠学习记忆的影响通过Morris水迷宫对实验小鼠进行学习记忆考察,发现短期内饲喂或／和注射牛脑组织提取物对幼龄小鼠的学习与记忆能力有明显提高,但连续150d饲喂或／和注射牛脑组织提取物会导致小鼠在成年期时表现出学习与记忆能力的显著性下降。2.小鼠脑PrPC基因克隆、原核表达采用PCR方法从小鼠脑组织基因组DNA中获得编码朊蛋白核心片段的DNA,用限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ酶切空载体pET-32a(+)和PCR产物,纯化后用T4DNA连接酶链接,成功构建重组表达质粒MPrP-pET-32a(+), PCR筛选鉴定阳性克隆,测序结果显示：连续摄入牛脑提取物150d后,Ⅰ组和Ⅱ组两个实验组小鼠的PRNP基因突变位点主要集中在370bp-500bp之间,共有6个位点发生突变,2个位点发生A突变为G或者C,4个位点的G碱基发生突变的。氨基酸变化主要集中在110AA-175AA,除了其中3个位点的丙氨酸发生改变以外,其它位点的变化并没有明显的规律性。阳性质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定表明,我们成功构建重组表达质粒MPrP-pET-32a(+),并转入表达宿主菌E.coil BL21,用IPTG进行诱导表达。结果证实PRNP所表达出大小为37Ku的重组融合蛋白,与预期蛋白大小相一致。3.牛脑提取物对小鼠脑朊蛋白结构和功能的影响通过免疫组织化学方法检测小鼠脑组织中prpsc蛋白的分布,结果显示：各个阶段的实验小鼠脑组织灰质区内均未出现prpsc蛋白。通过免疫印迹检测朊蛋白糖基化的水平,结果显示：经蛋白酶K处理后,所有实验组动物的脑组织内均未出现PK抗性条带,说明各组实验小鼠脑组织中不存在PrPsc。但进一步分析未经过蛋白酶K消化的实验小鼠脑组织匀浆液,发现：N-糖基化位点修饰PrP表达不完全的糖基化形式,分子量在32ku；经糖苷酶PNGase F消化除去蛋白的糖类残基,电泳条带下移。而去N-糖基化修饰PrPc不具有N-糖基化的形式,分子量约29ku, Western blot检测条带证实了PrPc糖类残基被全部出去。测定去糖基化PrPc含量上,采用Image J测定蛋白条带的灰度值,与对照组相比,Ⅱ组实验动物脑组织匀浆液中无糖基化形式的PrPc表达量有明显的上升(P<0.05),这提示长期摄入牛脑的活性多肽后,小鼠脑组织中双糖基化修饰的PrPc分子、单糖基化修饰的PrPc分子与无糖基化修饰的PrPc分子三者在相互的含量上有一个明显的改变,但具体是何种糖基化形式发生转变,还有待进一步研究,不过感染终末期才出现的PrPc糖基化分子类型的变化在神经系统性疾病的发病过程中可能有一定的意义。