【摘 要】
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目的构建一个靶向Notch-1基因的rAAVl-shRNA载体,以阻断Notch-1基因的表达,观察沉默Notch-1基因后人胶质瘤肿瘤干细胞在裸鼠体内成瘤性的影响。方法设计针对Notch-1基因的靶D
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目的构建一个靶向Notch-1基因的rAAVl-shRNA载体,以阻断Notch-1基因的表达,观察沉默Notch-1基因后人胶质瘤肿瘤干细胞在裸鼠体内成瘤性的影响。方法设计针对Notch-1基因的靶DNA序列,构建pAAV-MCS2/siRNA-Notch-1的重组质粒,将该质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC,腺病毒辅助质粒pHelper共转染QBI-293A细胞,包装成带有Notch-1基因的重组腺相关病毒。用无血清培养法从人胶质瘤细胞株U251中培养分离出肿瘤干细胞,以最适感染复数(MOI)感染肿瘤干细胞。将细胞分为三组：rAAV-EGFP-Notch-1转染组、空载体(rAAV-EGFP)转染组和未转染病毒的空白对照组,然后将每组细胞悬液分别注射裸鼠5只,观察其成瘤性情况,20天后处死动物,常规石蜡组织切片进行Notch-1的免疫组化染色测定。结果PCR鉴定分析结果表明成功构建了针对Notch-1的siRNA重组腺相关病毒载体,滴定法测定重组病毒载体基因组得到滴度为1.2×1012VP/L的高滴度腺相关病毒。用无血清培养法在胶质瘤细胞株U251中成功分离出肿瘤干细胞,免疫荧光监测显示该细胞CD133和Nestin的表达呈阳性。裸鼠的体内致瘤性实验显示rAAV-EGFP-Notch-1转染组肿瘤体积显著小于另外两组,说明肿瘤生长受到抑制,免疫组化结果显示该组肿瘤组织的Notch-1蛋白的表达亦有明显降低。结论成功构建携带Notch-1基因短发夹状干扰RNA的腺相关病毒载体,为下一步探索Notch-1基因在胶质母细胞瘤肿瘤干细胞中的作用提供实验基础。靶向阻断Notch-1基因可以有效抑制人胶质瘤U251肿瘤干细胞裸鼠皮下肿瘤的生长,这为胶质瘤的治疗提供新的思路。
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