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诱导型多能性干细胞具有胚胎干细胞的两大特征,即自我更新能力和分化成几乎机体的所有类型细胞的能力。此外,诱导型多能性干细胞有望克服胚胎干细胞面临的伦理问题,在毒理学、药物筛选、疾病模型及再生医学中有广阔的应用前景。阻碍诱导型多能性干细胞应用于临床的主要问题是效率和安全性,而解决这两个问题的关键是体细胞重编程的机理研究。体细胞重编程的过程涉及早期体细胞相关基因的沉默和后期多能性调控网络的激活。我们想从基因转录水平探究多能性基因是如何激活的。首先,我们比较了MEFs,重编程过程不同阶段的细胞和iPSCs的RNA pol Ⅱ的ChIP-Seq,发现RNA pol Ⅱ在重编程的早期已经结合在多能性基因的启动子附近但暂停在那里不能进入转录延伸阶段。P-TEFb是CDK9和cyclinT1/2/K组成的复合物,能够磷酸化RNA pol Ⅱ碳末端结构域的二位丝氨酸残基,从而调控基因的转录延伸。我们想通过调控P-TEFb来研究多能性基因的转录延伸在重编程中的作用。CDK9是P-TEFb的催化亚基,我们首先在诱导重编程的过程中用shRNA抑制CDK9的表达,结果重编程被抑制。CDK9的抑制剂FP及CDK9的失活突变体CDK9 DN同样抑制重编程。但抑制CDK9不影响AP+克隆的形成,尽管这些克隆为GFP-,暗示转录延伸主要在重编程的后期发挥作用。为了进一步验证这个假设,我们构建了可诱导表达的CDK9 DN,并在重编程的不同时期诱导其表达,发现只有在重编程后期表达CDK9 DN时才会抑制GFP+克隆的形成效率。此外,qPCR结果显示CDK9 DN抑制多能性基因的表达,而对MET相关基因没有影响。但过表达CDK9不影响重编程的效率,推测可能P-TEFb的活性而非表达水平调控重编程。P-TEFb在细胞内的活性受到严密的正负调控。BRD4能与CDK9相互作用而使之活化,HEXIM1,7SKRNA与之结合时则抑制其活性。我们发现在重编程过程中过表达BRD4可以促进重编程,而用shRNA或BRD4的抑制剂JQ1处理细胞时则抑制重编程。通过构建包含BRD4不同结构域的质粒并与Yamanaka因子共表达,发现只有全长的BRD4和包含BRD4-CTD的肽段能够促进重编程,并且过表达BRD4-CTD时促进重编程的效果更显著。这说明BRD4促进重编程是通过BRD4-CTD结构域。此外,我们还构建了BRD4及BRD4-CTD的突变体——突变BRD4-CTD结构域中与CDK9相互作用的氨基酸残基,突变的BRD4以及BRD4-CTD都不能促进重编程,进一步说明BRD4促进重编程是通过与P-TEFb相互作用。通过构建可诱导表达的BRD4-CTD,我们发现只有在后期表达BRD4-CTD才可以促进重编程,这与CDK9在重编程后期发挥作用相一致。qPCR结果显示过表达BRD4以及BRD4-CTD时都能促进多能性基因的表达,而不影响MET相关基因的表达。相反,重编程过程中用shRNA抑制BRD4表达时可抑制多能性基因的表达；在ESCs中用shRNA抑制BRD4表达使其不能维持多能性状态而分化。此外,我们发现BRD4-CTD能促进人尿液细胞的重编程。RNApolⅡ的ChIP-qPCR结果表明在重编程过程中过表达BRD4-CTD时,促进RNA polⅡ在Nanog, Oct4, Utf1和Dppa2等多能性基因的编码区的结合,暗示这些多能性基因的表达水平更高。此外,当我们在重编程的过程中过表达HEXIM1时重编程被抑制,多能性基因的表达也被抑制；而用shRNA抑制HEXIM1表达时有相反的效应。总的来说,我们的研究表明P-TEFb调控的多能性基因的转录延伸是体细胞重编程的一个关键因素。