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链球菌对喹诺酮类抗菌药产生耐药的机制主要有三种,一是药物作用靶位的基因突变,二是细菌外排泵系统的过度表达,三是质粒介导耐药基因的水平传播。本课题从不同方面分析研究了猪链球菌对喹诺酮类抗菌药的耐药机制,具体研究内容如下：1人工诱导猪链球菌氟喹诺酮耐药株的靶位突变分析以4株临床分离的对环丙沙星和恩诺沙星敏感的猪链球菌2型菌株为研究对象,采用体外递增药物浓度的方法分别诱导了对环丙沙星和恩诺沙星耐药的菌株,按CLSI规定的标准方法测定了环丙沙星和恩诺沙星对亲本株和诱导株的MIC,并测定了亲本株和诱导株的生长曲线,采用PCR和基因测序的方法分析了诱导株的DNA回旋酶(gyrA和gyrB)和拓扑异构酶Ⅳ(parC和parE)耐药决定区(QRDR)的基因突变和氨基酸序列变化。结果表明：浓度递增法可以成功诱导猪链球菌对环丙沙星和恩诺沙星耐药,其MIC分别可由原来的0.5 mg·L-1上升至128 mg·L-1;各药诱导耐药株生长均比其亲本株慢；恩诺沙星与环丙沙星诱导的耐药菌在DNA回旋酶(gyrA和gyrB)和拓扑异构酶Ⅳ(parC和parE)耐药决定区(QRDR)的基因和氨基酸序列变化有所不同,除了通常所报道的与喹诺酮耐药相关的parC的Ser79Phe和gyrA的Ser81 Arg的突变位点外,本试验还在耐药菌中发现了gyrB的Asp315Asn、Ser285Leu、Glu354Lys及parE的Pro278Ser点突变,与部分文献报道结果一致。但是在诱导菌中还出现了一些不曾有报道的突变位点和氨基酸的缺失,如gyrA的Gln118His、gyrB的288-291位和parC的62位氨基酸缺失以及parE的Asn297Tyr的突变,提示猪链球菌对喹诺酮类抗菌药的耐药形成因素可能还有其他未发现的机制。2氟喹诺酮对临床分离猪链球菌的防耐药变异浓度测定及一步突变株的筛选分别用微量肉汤稀释法(CLSI规定的标准方法)和琼脂二倍稀释法测定了四种氟喹诺酮抗菌药(环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星)对临床分离的32株喹诺酮敏感的猪链球菌的体外最小抑菌浓度(MIC)和防耐药变异浓度(MPC),并筛选一步突变耐药株；分别与利血平和氰氯苯腙(CCCP)联合用药,检测了各抗菌药突变选择窗(MSW)内富集的一步耐药突变株是否存在主动外排泵机制；采用PCR和基因测序的方法检测在不同药物突变选择窗内筛选出的猪链球菌一步耐药突变株的DNA回旋酶(gyrA和gyrB)和拓扑异构酶Ⅳ(parC和parE)耐药决定区(QRDRs)的基因突变和氨基酸序列变化,探明猪链球菌耐喹诺酮类药物的作用机制,分析不同氟喹诺酮药物在抑制猪链球菌时的特点,为临床用药提供依据。结果显示：四种药对猪链球菌的MIC值从小到大依次为：环丙沙星=恩诺沙星<氧氟沙星<甲磺酸培氟沙星,MPC值从小到大依次为：恩诺沙星<氧氟沙星<环丙沙星<甲磺酸培氟沙星,选择指数(MPC/MIC)除了环丙沙星为16之外其余药物均为2；只在环丙沙星的耐药突变窗内筛选到了耐药株,但其DNA回旋酶(gyrA和gyrB)和拓扑异构酶Ⅳ(parC和parE)耐药决定区(QRDR)没有碱基或氨基酸的突变；与利血平联合用药时检测到了外排机制。3体外筛选的喹诺酮类耐药猪链球菌对环丙沙星的蓄积动力学研究采用微量肉汤稀释法(CLSI规定的标准方法)测定盐酸环丙沙星对猪链球菌喹诺酮抗菌药耐药株的最小抑菌浓度(MIC),并分别和利血平或氰氯苯腙(CCCP)联合用药探究其对猪链球菌喹诺酮耐药株耐药性的影响；用高效液相(HPLC)的方法分别测定猪链球菌喹诺酮敏感株和耐药株细胞内环丙沙星的蓄积浓度,比较其差异。结果显示,盐酸环丙沙星与利血平联合用药时,猪链球菌喹诺酮耐药株对其的MIC值显著降低,但盐酸环丙沙星与氰氯苯腙(CCCP)联合用药时,其MIC值与环丙沙星单独用药时基本一致；各菌株对盐酸环丙沙星的摄取曲线表明,猪链球菌喹诺酮耐药株内盐酸环丙沙星的蓄积浓度要低于敏感株,且达到最高摄取浓度的时间也不一致。本研究结果表明猪链球菌喹诺酮耐药株中存在外排泵。