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背景与目的:肝癌是常见的恶性肿瘤之一,而我国则是全球肝癌发病率最高和病死数最多的国家。目前肝癌的临床治疗尚无有效的靶向药物,且高复发率和转移率导致患者生存率低于30%,因此寻找治疗肝癌的有效靶向药物是亟待解决的问题。固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是一类调控脂类代谢重要的核转录因子。研究发现,SREBPs及其调控的与脂类代谢相关的关键酶在肝癌组织中表达上调,SREBPs的抑制或失活可抑制肝癌细胞生长。因此,SREBPs被认为是以脂类代谢为靶向的抗癌方案中最有前景的靶点。桦木脑是SREBPs的特异性抑制剂,可抑制SREBPs的活化。多项研究表明桦木脑的抗肿瘤活性具有广谱性,但作用机制尚不明确。我们的前期研究印证了桦木脑对肝癌细胞(HepG2)增殖的抑制作用,还发现SREBP1可调控凋亡基因的表达,提示SREBP1在肿瘤细胞中存在新的调控机制。据此本课题将以SREBP1为研究核心,阐释SREBP1在肿瘤中的作用以及桦木脑抗肝癌作用的分子机制,为肝癌的临床治疗提供新的策略和实验依据。实验方法:1.肝癌细胞(Hep G2)增殖、周期和凋亡的测定:用浓度分别为0μg/m L、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的桦木脑处理HepG2细胞0h、24h、48h、72h、96h后,MTT法检测细胞的增殖情况;流式细胞仪检测细胞的凋亡和周期情况;qRT-PCR检测细胞凋亡相关基因、周期蛋白和周期蛋白激酶的mRNA表达水平。2.差异表达基因的确定及功能分析:利用RNA-seq实验技术筛选出HepG2细胞中的表达基因;分析比较桦木脑组和DMSO对照组的差异表达基因(DEGs)。3.转录因子通路分析及其验证:为了验证RNA-seq的分析结果,我们对转录因子进行通路分析;然后qRT-PCR实验和Western blot实验对分析结果进行进一步验证。4.KEGG通路富集分析:为了深入了解DEGs的生物学功能,我们对993个DEGs进行KEGG通路富集分析。5.转录因子结合位点临近基因的预测:为了预测SREBP1下游的靶基因,我们先对其结合位点临近基因进行预测:ChIP-Seq实验数据和ChIP-seeker程序注释预测启动子区可能存在SREBP1结合位点的候选靶基因。6.转录因子靶基因的预测及功能分析:为了预测SREBP1下游的靶基因,我们将ChIP-Seq实验数据和DEGs进行整合;并筛选出SREBP1调控的与凋亡相关的基因;双荧光素酶报告系统检测SREBP1对此凋亡基因的调控作用及qRT-PCR实验检测桦木脑处理下此凋亡基因的mRNA表达量。7.分析PIK3R3过表达与肝癌的相关性:根据TCGA转录数据、GEO数据库的肝癌转录组数据及meta分析,分析HCC中PIK3R3的表达程度。实验结果:1.桦木脑明显抑制HepG2的增殖,并呈浓度依赖性;筛选出桦木脑的最佳用药浓度为10μg/m L。2.qRT-PCR结果显示,桦木脑处理下周期蛋白和周期蛋白激酶如CDK1、CDK6等mRNA水平呈下调趋势,而周期抑制蛋白如P21、P27等mRNA水平上调;促凋亡基因如BAX等mRNA水平上调,而抑凋亡基因如Bcl-xl、Bcl-2等mRNA表达量下调;核内的SREBP1、FASN的mRNA水平均下调;Western blot结果显示,桦木脑处理下核内的SREBP1及FASN、CDK1、CDC25A的蛋白表达量下调。3.RNA-Seq结果表明:在桦木脑和DMSO处理下,HepG2细胞共发现17,339个基因表达(任意一组的RPKM>0);两组组间比较筛查到差异表达基因为993个(FDR<0.01),占表达基因总数的5.73%,其中包括上调基因464个,下调基因529个。4.转录因子通路分析验证了桦木脑通过抑制SREBP1核型的激活,调控下游靶基因的表达,是SREBP1的抑制剂。5.KEGG通路富集分析结果提示:桦木脑调控SREBP1的表达不但会影响脂质代谢还可影响细胞生存。6.SREBP1作为转录因子主要结合于下游基因的启动子区域发挥调控功能。且桦木脑可通过抑制SREBP1的表达从而下调凋亡基因PIK3R3的表达。7.肝癌组织中的PIK3R3表达程度较非肝癌组织程度高,在肿瘤组织中的PIK3R3的表达程度均比癌旁组织高。实验结论:1.桦木脑能显著抑制肝癌细胞(HepG2)的增殖,诱导其凋亡,并且使其阻滞在G2/M期。2.桦木脑抑制肝癌细胞增殖的作用机制与其直接下调凋亡基因PIK3R3的表达,促进细胞凋亡有关。