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【研究目的】急性肺损伤(acute lung injury,ALI)或急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是创伤,脓毒症和感染等主要临床并发症,而内皮屏障功能缺失在ALI/ARDS发展过程中发挥重要作用,并与肺血管内皮细胞(endothelial cell,EC)严重损伤直接相关。血管生成素1和2(angiopoietin,Ang-1&2),是ECs生长因子,竞争性作用于ECs表面的络氨酸激酶受体2(tyrosine kinase receptor 2,Tie2)。Ang-1/Tie2结合并使Tie2磷酸化,促进下游抗炎性信号通路,维持血管屏障完整性;而Ang-2产生于活化的ECs,作用于Tie2发挥明显的拮抗效应。目前研究认为Tie1为孤儿受体,也表达于ECs表面,但并不与配体Ang-1和Ang-2相结合,而是通过与Tie2形成异源二聚体发挥生物学效应,而且Tie1可以抑制Ang-1/Tie2的结合,从而促进EC活化。文献报道ALI/ARDS患者外周血Ang-2浓度是明显高于正常对照;前期通过建立失血性休克复合盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)诱导的小鼠ALI模型,证实中性粒细胞与ECs的相互作用导致了Ang-2表达上调,并且介导Ang-2相关的肺EC功能障碍,说明Ang/Tie信号通路在急性肺损伤形成过程中发挥了重要作用。那么作为内皮细胞表面受体Tie1和Tie2是否参与了肺损伤的形成,失血性休克活化的中性粒细胞是否通过调节Tie1和Tie2表达而介导肺损伤呢?目前尚未见相关报道。因此,本研究拟建立“两次打击(失血性休克/脓毒症)”诱导的ALI/ARDS小鼠模型,探讨Tie1/Tie2在失血性休克-脓毒症两次打击致肺损伤中表达变化,以及中性粒细胞在其中发挥的作用,从而完善血管生成素-Tie信号通路在急性肺损伤中的作用,并为临床预防和治疗急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征提供一定的实验理论基础及潜在的治疗靶点。【研究方法】一、探究Tie1和Tie2在失血性休克-脓毒症两次打击致急性肺损伤中的表达24只正常雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6小鼠,8-10周龄,随机分为正常小鼠组(Na?ve),假手术组(Sham hemorrhage/CLP,Shem/C)和模型组(H/C),H/C组分别在休克后6h、24h进行盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP),即又分为H6/C和H24/C组,Shem/C组小鼠不进行失血性休克,只进行CLP。各组小鼠于CLP后24h收集血浆和肺组织,酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测肺组织上清液中Tie1、Tie2及Tie2磷酸化水平;免疫迹法(Western blot,WB)检测肺组织液中Tie2蛋白水平及其磷酸化水平表达,旨在探究Tie1/Tie2在失血性休克-脓毒症两次打击致急性肺损伤中的表达情况。二、研究Tie1在失血性休克-脓毒症两次打击致急性肺损伤中的作用24只雄性C57BL/6(8-10周龄)小鼠随机分为以下四组:正常小鼠组(Na?ve)、H/C组和H/C+Tie1 siRNA组,其中,H/C+Tie1 siRNA组小鼠分别于休克后1h尾静脉注射脂质体包封的Tie1 siRNA(65ug/只),H/C小鼠于同时间点尾静脉注射等体积的生理盐水(normal saline,NS)。CLP术后24h处死小鼠采集血浆、肺组织及肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage,BAL)。肺组织H&E染色评估肺组织病理改变;ELISA方法测定血浆和肺组织中Tie1的表达,评价Tie1 siRNA在小鼠体内的干扰效率;ELISA方法检测肺组织中细胞因子(IL-6,TNF-ɑ,IL-10)和中性粒细胞趋化因子MIP2水平;MPO法评估肺脏中性粒细胞浸润程度;BCA蛋白定量法检测BALF中总蛋白浓度,评估肺泡渗透性,目的在于探讨Tie1是否介导失血性休克-脓毒症两次打击致急性肺损伤。三、探讨中性粒细胞对两次打击致急性肺损伤Tie1和Tie2表达的调节作用将24只雄性C57BL/6(8-10周龄)小鼠随机分为以下四组:Na?ve组、H/C组、抗中性粒细胞抗体+H/C组(anti-Gr-1+H/C)和同型对照抗体+失血性休克-脓毒症组(isotype+H/C),每组6只。正常小鼠腹腔注射anti-Gr-1抗体(500ug/mouse),对照小鼠腹腔给予等量的isotype抗体,48h后构建失血性休克-CLP模型。CLP术后24h获得外周血和肺组织,流式细胞评估外周血中性粒细胞数;H&E染色评估去除中性粒细胞后肺损伤病理的改变;ELISA法检测肺组织中炎征因子(IL-6、TNF-ɑ,IL-10和MIP2)水平,评估中性粒细胞在肺损伤炎症反应中的作用;ELISA检测肺组织中Tie1/Tie2的表达,以进一步探讨中性粒细胞在失血性休克-脓毒症两次打击致急性肺损伤时Tie1/Tie2表达变化中的作用。【结果】一、Tie1和Tie2在小鼠失血性休克-脓毒症两次打击致急性肺损伤中的表达Tie1在失血性休克6h、24h-CLP致肺损伤中表达持续升高,而Tie2磷酸化水平在失血性休克后6h-CLP致肺损伤中下调,失血性休克后24h-CLP致肺损伤回升至正常水平。以上提示Tie1/Tie2在失血性休克-脓毒症致急性肺损伤形成过程中表达发生了改变。二、Tie1在小鼠失血性休克-脓毒症两次打击致急性肺损伤中的作用Tie1 siRNA可显著降低血浆和肺组织Tie1表达;Tie1低表达的急性肺损伤小鼠肺损伤显著改善,表现为肺组织结构恢复趋于正常,MPO反应降低,肺泡总蛋白浓度显著下降,并肺组织中IL-6和MIP2水平明显降低,提示Tie1可能参与了急性肺损伤的形成。三、中性粒细胞对两次打击致急性肺损伤中Tie1和Tie2表达的调节作用抗中性粒抗体耗竭中性粒细胞后,两次打击致急性肺损伤小鼠肺组织炎征反应减轻和损伤显著改善,并且Tie1的表达显著下调,Tie2磷酸化水平明显上调,提示中性粒细胞可能通过调节Tie1/Tie2表达介导了肺损伤。【结论】Tie1/Tie2在失血性休克-脓毒症致急性肺损伤中表达有显著改变;中性粒细胞通过调节Tie1/Tie2表达在失血性休克-脓毒症两次打击致急性肺损伤中发挥重要作用;Tie1是导致中性粒细胞相关急性肺损伤的原因之一,是急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征潜在的治疗靶点和生物标记物。