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苹果炭疽叶枯病为我国苹果一种新病害，主要病原为果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)。果生炭疽菌不仅危害苹果果实，而且侵染叶片，严重影响苹果产量和质量。该菌以半活体营养方式侵染苹果组织，在致病过程中可以分泌效应蛋白促进其侵染。效应蛋白为真菌重要致病因子，研究其功能及互作蛋白有助于解析炭疽菌致病及寄主抗病机制。前期本研究室筛选到果生炭疽菌效应蛋白CfCE12，其在致病中发挥重要作用。本研究拟利用酵母双杂从侵染文库筛选与苹果互作靶标蛋白，运用酵母双杂交、双分子荧光互补(BiFC)及免疫共沉淀(CoIP)验证候选互作蛋白关系，并分析CfCE12与靶标蛋白互作影响寄主免疫的原因，取得以下主要研究结果：
(1)利用酵母双杂交系统以效应蛋白CfCE12为诱饵蛋白在果生炭疽菌侵染苹果叶片不同时期的cDNA文库中筛选获得35个候选蛋白。进一步通过酵母体内验证、双分子荧光互补(BiFC)、免疫共沉淀(CO-IP)试验发现CfCE12与苹果MdNIMIN2能发生互作，为果生炭疽菌效应蛋白的互作蛋白。烟草瞬时表达显示CfCE12与MdNIMIN2共定位于细胞核。目前，尚未发现其它效应蛋白以MdNIMIN2为靶向的病原菌，因此二者的互作可能代表病原物一种新致病机制。
(2)通利用C.fructicola接种苹果叶片，通过qRT-PCR分析不同时间点NIMIN基因表达水平，结果显示MdNIMIN1及MdNIMIN3在果生炭疽菌侵染8h显著上调表达，MdNIMIN2在侵染24h显著上调表达。表明NIMIN不同基因果生炭疽菌侵染差异表达。
(3)烟草上过表达MdNIMIN2后，发现MdNIMIN2可以显著增强烟草对疫霉菌(Phytophthora nicotianae)的抗性，qRT-PCR显示PR1与NPR1基因均上调表达；而烟草上瞬时表达CfCE12，发病程度则明显加重，同时qRT-PCR显示PR1与NPR1基因表达受到抑制；共表达MdNIMIN2和CfCE12，则发病程度与空载体相当。这些结果表明CfCE12通过影响MdNIMIN2的生物学功能影响烟草抗性。
(4)对CfCE12及同源蛋白氨基酸序列构建系统发育树，结果显示在炭疽菌属胶孢群物种中均含有CfCE12蛋白，不同种炭疽菌的CfCE12氨基酸序列相似性在96%以上，表明CfCE12为胶孢群真菌共有保守蛋白。该蛋白N端具有18个氨基酸构成的信号肽及64个氨基酸组成的CFEM结构域。在烟草上表达CFEM结构域缺失突变体丧失抑制Bax引起坏死功能，表明该结构域为效应蛋白CfCE12的关键作用区段。酵母双杂亦确定CFEM为CfCE12-MdNIMIN2互作的关键区段。
(5)NIMIN2为NPR1的辅助调控因子，为了明确CfCE12与MdNIMIN2互作对MdNIMIN2与MdNPR1互作程度的影响，利用酵母三杂系统分析了CfCE12、MdNIMIN2和MdNPR1三者的关系，结果显示CfCE12不表达时，MdNIMIN2与MdNPR1可以结合，CfCE12表达时，MdNIMIN2与MdNPR1不能结合，表明CfCE12与MdNIMIN2结合能够抑制MdNIMIN2与MdNPR1的结合。
(6)为了进一步明确CfCE12与MdNIMIN2结合影响MdNIMIN2与MdNPR1结合的原因，构建了MdNIMIN2的分段突变体，利用酵母双杂分别验证MdNIMIN2-CfCE12及MdNIMIN2-MdNPR1结合的区段，结果显示与CfCE12互作的区域位于MdNIMIN2的13—81位氨基酸，与MdNPR1互作区域位于MdNIMIN2的13—64位氨基酸，说明MdNIMIN2以部分相同区段分别与CfCE12和MdNPR1结合，即CfCE12通过竞争性结合MdNIMIN2抑制MdNIMIN2-MdNPR1结合。
综上所述，本研究明确了果生炭疽菌效应蛋白CfCE12与寄主蛋白MdNIMIN2直接互作关系，CFEM结构域为CfCE12互作的关键区段，效应蛋白CfCE12通过竞争性结合MdNIMIN2抑制了其与MdNPR1结合，进而影响PR1表达。本研究发现果生炭疽菌CFEM结构域具有与NIMIN2互作新功能，首次发现果生炭疽菌效应蛋白CfCE12靶向MdNIMIN2抑制寄主免疫新机制。
(1)利用酵母双杂交系统以效应蛋白CfCE12为诱饵蛋白在果生炭疽菌侵染苹果叶片不同时期的cDNA文库中筛选获得35个候选蛋白。进一步通过酵母体内验证、双分子荧光互补(BiFC)、免疫共沉淀(CO-IP)试验发现CfCE12与苹果MdNIMIN2能发生互作，为果生炭疽菌效应蛋白的互作蛋白。烟草瞬时表达显示CfCE12与MdNIMIN2共定位于细胞核。目前，尚未发现其它效应蛋白以MdNIMIN2为靶向的病原菌，因此二者的互作可能代表病原物一种新致病机制。
(2)通利用C.fructicola接种苹果叶片，通过qRT-PCR分析不同时间点NIMIN基因表达水平，结果显示MdNIMIN1及MdNIMIN3在果生炭疽菌侵染8h显著上调表达，MdNIMIN2在侵染24h显著上调表达。表明NIMIN不同基因果生炭疽菌侵染差异表达。
(3)烟草上过表达MdNIMIN2后，发现MdNIMIN2可以显著增强烟草对疫霉菌(Phytophthora nicotianae)的抗性，qRT-PCR显示PR1与NPR1基因均上调表达；而烟草上瞬时表达CfCE12，发病程度则明显加重，同时qRT-PCR显示PR1与NPR1基因表达受到抑制；共表达MdNIMIN2和CfCE12，则发病程度与空载体相当。这些结果表明CfCE12通过影响MdNIMIN2的生物学功能影响烟草抗性。
(4)对CfCE12及同源蛋白氨基酸序列构建系统发育树，结果显示在炭疽菌属胶孢群物种中均含有CfCE12蛋白，不同种炭疽菌的CfCE12氨基酸序列相似性在96%以上，表明CfCE12为胶孢群真菌共有保守蛋白。该蛋白N端具有18个氨基酸构成的信号肽及64个氨基酸组成的CFEM结构域。在烟草上表达CFEM结构域缺失突变体丧失抑制Bax引起坏死功能，表明该结构域为效应蛋白CfCE12的关键作用区段。酵母双杂亦确定CFEM为CfCE12-MdNIMIN2互作的关键区段。
(5)NIMIN2为NPR1的辅助调控因子，为了明确CfCE12与MdNIMIN2互作对MdNIMIN2与MdNPR1互作程度的影响，利用酵母三杂系统分析了CfCE12、MdNIMIN2和MdNPR1三者的关系，结果显示CfCE12不表达时，MdNIMIN2与MdNPR1可以结合，CfCE12表达时，MdNIMIN2与MdNPR1不能结合，表明CfCE12与MdNIMIN2结合能够抑制MdNIMIN2与MdNPR1的结合。
(6)为了进一步明确CfCE12与MdNIMIN2结合影响MdNIMIN2与MdNPR1结合的原因，构建了MdNIMIN2的分段突变体，利用酵母双杂分别验证MdNIMIN2-CfCE12及MdNIMIN2-MdNPR1结合的区段，结果显示与CfCE12互作的区域位于MdNIMIN2的13—81位氨基酸，与MdNPR1互作区域位于MdNIMIN2的13—64位氨基酸，说明MdNIMIN2以部分相同区段分别与CfCE12和MdNPR1结合，即CfCE12通过竞争性结合MdNIMIN2抑制MdNIMIN2-MdNPR1结合。
综上所述，本研究明确了果生炭疽菌效应蛋白CfCE12与寄主蛋白MdNIMIN2直接互作关系，CFEM结构域为CfCE12互作的关键区段，效应蛋白CfCE12通过竞争性结合MdNIMIN2抑制了其与MdNPR1结合，进而影响PR1表达。本研究发现果生炭疽菌CFEM结构域具有与NIMIN2互作新功能，首次发现果生炭疽菌效应蛋白CfCE12靶向MdNIMIN2抑制寄主免疫新机制。