目的:本实验的目的是研究分泌型Klotho（SKL）对人脂肪干细胞（h ADSCs）成脂与存活的影响。通过分离提纯SKL,细胞培养,Western Blot,体内裸鼠实验等实验方法证明SKL促进h ADSCs存活,促进成脂分化,抑制凋亡,靶向调控P-AMPKα、LC3等蛋白的表达,为临床软组织损伤修复提供实验依据。方法:1.体外条件下培养293T细胞,分为正常对照组（N组）和Klotho过表达组,用空载质粒转染细胞作为N组,带有SKL基因的质粒转染细胞作为Klotho过表达组。Western Blot检测转染后的细胞以及培养基中分泌型Klotho蛋白。然后收集无血清培养基,利用蛋白纯化镍柱提取Klotho蛋白。2.体外条件下培养h ADSCs,将细胞均匀铺在六孔板上,按照SKL的浓度共分为四组:N组、0.1μg/ml组、1μg/ml组、10μg/ml组。细胞提蛋白,Western Blot检测SKL不同浓度处理下的P-AMPKα、AMPKα、LC3蛋白的表达。3.将细胞均匀铺在六孔板上,按照组别进行添加AMPK激活剂（AICAR）和抑制剂（Compound C）,分为七组:N组、SKL组、AICAR（A）组、Compound C（C.C）组、SKL+AICAR（SKL+A）组、SKL+Compound C（SKL+C.C）组。48h后提细胞蛋白,利用Western Blot实验技术检测PAMPKα、AMPKα蛋白的表达。4.将细胞分为四组:N组、SKL组、A组、SKL+A组于六孔板中培养,利用成脂诱导液诱导细胞定向分化。取出细胞爬片,进行油红O染色。5.将细胞分为四组:N组、SKL组、C.C组、SKL+C.C组于六孔板中培养,加入成脂诱导液诱导细胞定向分化,将细胞爬片使用甘油明胶封片剂封闭在载玻片上,油红O染液进行染色,对成脂效果鉴定。6.制备脂肪脱细胞基质（DAT）水凝胶,将裸鼠分为七组:DAT组、DAT+h ADSCs组、DAT+h ADSCs+SKL组、DAT+h ADSCs+A组、DAT+h ADSCs+SKL+A组、DAT+h ADSCs+C.C组、DAT+h ADSCs+SKL+C.C组,体内注射方式将细胞植入皮下,四周后进行Micro-CT检测,组织取材,组织学切片,油红O染色、HE染色、免疫荧光等实验。结果:1.Western Blot检测结果显示转染后的细胞中以及293T细胞的无血清培养基中SKL蛋白含量显著高于对照组。蛋白纯化镍柱提纯的SKL纯度以及蛋白含量达到后续实验所需浓度要求。2.流式细胞仪结果显示SKL促进h ADSCs增殖与存活,抑制h ADSCs凋亡。3.Western Blot检测结果显示,随着SKL浓度升高,h ADSCs中P-AMPKα蛋白表达量逐渐降低,LC3蛋白表达量逐渐升高。h ADSCs成脂过程中,分泌型Klotho蛋白表达量逐渐升高。4.细胞爬片油红O染色结果证实SKL组大量脂滴存在,SKL促进h ADSCs成脂分化。5.体内实验,通过不同药物处理后的h ADSCs与DAT融合后植入体内,4周进行Micro-CT检测,取材后固定,做冰冻切片,油红O染色证实SKL组脂滴丰富,成脂效果显著。AICAR组抑制成脂,Compound C组同样抑制成脂分化,进一步明确SKL促进成脂的效果并不仅仅是通过AMPK途径;免疫荧光结果显示SKL促进C/EBPα上调,SKL组荧光效果最强。结论:实验结果表明SKL可以显著促进h ADSCs存活以及自噬,SKL可能通过下调PAMPKα蛋白的表达,促进h ADSCs成脂分化。