论文部分内容阅读
目的:HIV-1 Tat是HIV-1 tat基因编码的重要调控蛋白,可参与病毒的转录与激活,促进病毒在细胞内的复制;同时Tat蛋白还可以借助被HIV-1感染的T细胞、巨噬细胞等多种细胞分泌、释放到细胞外,借助自身的穿膜功能,到达机体多个部位。研究表明,大部分HIV-1感染者后期,尤其是发展成为艾滋病脑病和艾滋病脑炎的患者,血脑屏障(blood brain barrier,BBB)都有不同程度的结构损伤和功能减退。内皮细胞是血脑屏障的第一道防线,在控制BBB物质进出、维持BBB动态平衡发挥重要作用。紧密连接蛋白是内皮细胞间相互连接的复杂结构,降低紧密连接蛋白的表达量可增加内皮细胞的通透性。紧密连接蛋白主要是由跨膜蛋白、胞质附着蛋白和细胞骨架蛋白三种组成,闭合小环蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)为胞质附着蛋白,在维持连接系统的稳定性、细胞信号转导、调节细胞增殖分化和血脑屏障通透性中发挥重要作用,常被用作观察紧密连接屏障功能和评价通透性功能的指标。HIV-1 Tat蛋白对内皮细胞的作用可分为两类:①直接作用:Tat蛋白可通过损伤内皮细胞的细胞器、上调促凋亡蛋白表达等方式损伤内皮细胞,也可降低紧密连接蛋白的表达量,增加内皮细胞的通透性;②间接作用:Tat蛋白刺激星形胶质细胞分泌促炎症介质,参与炎症反应,进而损伤内皮细胞。近些年,HIV-1 Tat蛋白损伤内皮细胞机制的研究众多,但其机制尚未阐释清楚。因此,对Tat蛋白损伤内皮细胞的机制进行全面、深入的研究对HIV相关神经认知障碍的预防、治疗以及控制具有重要意义。本研究在原核细胞中表达并纯化了 HIV相关脑病(HIV-associated dementia,HAD)患者基底核(basal ganglia,BG)来源HIV-1 Tat蛋白,研究了 HIV-1 Tat蛋白对内皮细胞的活性的影响,探讨HIV-1 Tat蛋白对内皮细胞的直接作用。同时在U87细胞中表达了 HAD、非HAD(non-HIV-associated dementia,non-HAD)患者脾脏(spleen,SPL)和BG来源Tat蛋白,研究了 U87细胞上清对原代小鼠脑微血管内皮细胞(mouse cerebral microvascular endothelial cells,MCMECs)紧密连接蛋白 ZO-1 含量的影响,探讨了 HIV-1 Tat蛋白对内皮细胞的间接作用,以期为HAD发病机制研究提供科学依据。方法:1.HIV-1 Tat对内皮细胞活性的影响(1)pET-32a-tat原核表达载体的构建 以测序正确的pGEX-KG-tat重组质粒为模板,扩增HAD-BG来源的HIV-1 tat基因,引物中加入His标签用于HIV-1 Tat蛋白的纯化。PCR产物和pET-32a载体进行酶切、连接,构建pET-32a-tat原核表达载体,将其转化大肠杆菌感受态DH5α,经氨苄青霉素筛选,挑取单菌落经菌液PCR鉴定后送公司测序,测序结果进行比对。(2)HIV-1 Tat蛋白的表达、纯化与定量构建成功的pET-32a-tat原核表达载体转化大肠杆菌感受态BL21(DE3),挑取单菌落接种于含1‰氨苄青霉素的LB培养基中,培养至吸光度(absorbance,A)在0.6～0.8之间,IPTG诱导其表达Tat蛋白。SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白表达。破碎菌体后,离心收取上清,通过镍亲和层析柱和凝胶过滤预装柱进行纯化,浓缩后经BCA蛋白定量目的蛋白。(3)HIV-1 Tat蛋白对HUVECs活性的影响将HUVECs接种至96孔板,加入Tat蛋白,终浓度依次为100 ng/ml,200 ng/ml,300 ng/ml,400 ng/ml,500 ng/ml,1000 ng/ml,每个浓度设5个平行孔,以正常细胞为阴性对照,培养基作为空白对照。作用36h后,加入cck-8溶液,酶标仪检测450nm波长处的A值。2.表达HIV-1 Tat蛋白的U87细胞上清对MCMECs ZO-1含量的影响(1)pEGFP-N1-tat真核表达载体的构建分别以含有HAD-SPL、HAD-BG、non-HAD-SPL、non-HAD-BG 的HIV-1 tat基因pGEX-KG-tat和pMD119-T-tat重组质粒作为模板,扩增不同来源的HIV-1 tat基因。PCR产物和pEGFP-N1载体进行酶切、连接,构建pEGFP-N1-tat真核表达载体,将其转化大肠杆菌感受态DH5α,经氨苄青霉素筛选,挑取单菌落经菌液PCR鉴定后送公司测序,测序结果进行比对。(2)HIV-1 Tat蛋白在U87细胞内的表达将构建成功的 HAD-SIL、HAD-BG、non-HAD-SPL、non-HAD-BG来源 Tat的真核表达载体pEGFP-NI1-tat转染U87细胞,并以正常细胞作为空白对照,pEGFP-N1载体组作为阴性对照。通过观察绿色荧光蛋白判断HIV-1 Tat蛋白表达情况,免疫组化法鉴定HIV-1 Tat在U87细胞内的表达。(3)原代MCMECs提取、培养与鉴定选取6～8只4～6周龄的昆明鼠,无菌取脑组织,剪碎并用木瓜蛋白酶和DNA酶I消化,加入1.7倍体积的22%BSA后离心,下层沉淀用内皮细胞培养基重悬后接种于包被鼠尾胶原I的培养板上。待细胞铺满单层后,免疫荧光技术检测细胞CD31和VIII因子,对原代培养的细胞进行鉴定。(4)表达HIV-1 Tat蛋白U87上清对原代MCMECs ZO-1含量的影响分别收集表达 HAD-SPL、HAD-BG、non-HAD-SPL、non-HAD-BG HIV-1 Tat蛋白的U87上清,并加入MCMECs中孵育,Western Blot检测MCMECs中ZO-1含量,以正常细胞作为空白对照,pEGFP-N1载体组作为阴性对照。经Image J软件对ZO-1与β-actin灰度值进行分析,通过计算ZO-1/β-actin比值,分析不同来源的U87细胞上清对ZO-1的蛋白含量的影响。3.统计学分析用SPSS 16.0软件对各组HUVECs活性和MCMECs ZO-1蛋白含量进行统计学处理,数据用均数士标准差(x±s)描述,采用方差分析进行检验(α =0.05)。结果:1.HIV-1 Tat对内皮细胞活性的影响(1)pET-32a-tat原核表达载体的构建PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,在250bp处出现与预计的tat第一外显子基因(216bp)片段大小相符的条带。挑取单菌落进行PCR鉴定证实为HIV-1 tat基因。测序结果比对正确,证明pET-32a-tat原核表达载体构建成功。(2)HIV-1 Tat蛋白的表达、纯化与定量SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果显示,在15KD处有明显的蛋白条带,与HIV-1 Tat蛋白大小一致,还有小部分以多聚体存在。同时结果显示大部分目的蛋白可溶性的在上清中表达,还有少部分在包涵体内。上清经镍亲和层析柱纯化,Western Blot结果可知,500mmol/L洗脱液中的目的蛋白含量较高,加入DTT对减少目的蛋白多聚体不显著。将500mmol/L洗脱峰收集后浓缩,经凝胶过滤预装柱Column Superdex 75 Increase 10/300 GL进一步纯化,AKTA explorer UV吸收图可见单个吸收峰。根据UV吸收图出峰位置可知,该蛋白为一分子量较大的多聚体,经鉴定为HIV-1 Tat蛋白,且在DTT作用下分解成以单体为主的多种形式。BCA测定浓度为0.47mg/ml。(3)HIV-1 Tat蛋白对HUVECs活性的影响随着Tat浓度的增加,HUVECs活性逐渐降低,与阴性对照组相比,100ng/ml、200ng/ml两组细胞活性差异均无统计学意义(P>0.05),300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml四组细胞活性差异均有统计学意义(P<0.05),但四组组间差异无统计学意义(P>0.05)。2.表达HIV-1 Tat蛋白的U87细胞上清对MCMECs ZO-1含量的影响(1)pEGFP-N11-tat真核表达载体的构建PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,在250bp处出现与预计的tat第一外显子基因(216bp)片段大小相符的条带。挑取单菌落进行PCR鉴定证实为HIV-1 tat基因。测序结果比对正确,证明 HAD-SPL、HAD-BG、non-HAD-SPL、non-HAD-BG 四组pEGFP-N 1-tat真核表达载体构建成功。(2)HIV-1 Tat蛋白在U87细胞内的表达HAD-SPL、HAD-BG、non-HAD-SPL、non-HAD-BG 四组 pEGFP-N11-tat 真核表达载体和pEGFP-N1载体转染U87细胞后,12h可观察到U87细胞内有绿色荧光出现,随时间延长,荧光强度逐渐增加,48h时达到最大值,72h时较之减弱,空白对照未见绿色荧光。转染48h的U87细胞经免疫组化法检测,各实验组均可见清晰的棕色颗粒,阴性对照和空白对照未见棕色颗粒。综上可知,HIV-1 Tat蛋白能在U87细胞内表达。(3)原代MCMECs提取、培养与鉴定从小鼠脑组织中提取、培养的细胞经免疫荧光法鉴定,CD31和Ⅷ因子检测结果均可见绿色荧光,经DAPI染色的细胞核可见蓝色荧光,表明提取培养的细胞为原代MCMECs。(4)表达HIV-1 Tat蛋白U87上清对原代MCMECs ZO-1含量的影响孵育表达 HAD-SPL、HAD-BG、non-HAD-SPL、non-HAD-BG 四组 Tat 蛋白的U87上清后,MCMECs紧密连接蛋白ZO-1含量出现了不同程度的变化。与阴性对照组相比,HAD-SPL和 non-HAD-SPL组 ZO-1 的含量降低;HAD-BG和 non-HAD-BG组的ZO-1的含量升高,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:1.在原核细胞中高效表达并纯化了具有生物学活性的HIV-1 Tat蛋白,浓度达到300ng/ml可显著降低HUVECs的活性。2.表达HAD-SPL、HAD-BG、non-HAD-SPL、non-HAD-BG Tat蛋白的 U87上清对MCMECs ZO-1含量无影响。