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第一部分 核素标记靶向EGFR西妥昔单抗Fab片段用于基底样乳腺癌放射免疫显像的初步研究
目的：本研究旨在利用核素 99mTc 和 68Ga 标记靶向 EGFR 单克隆抗体西妥昔单抗（Cetuximab）的抗原结合片段（Fab），评估其用于基底样乳腺癌放射免疫显像的可行性。
方法：对完整单克隆抗体Cetuximab用固定化木瓜蛋白酶酶切得到Cetuximab-Fab片段，SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）蛋白电泳检测其分子量，经细胞免疫荧光和流式细胞术检测其特异性和亲和活性。抗体Fab片段分别通过SHNH和L-NETA及TCO-Tz的“点击化学”反应标记放射性核素 99mTc和 68Ga。选择EGFR表达阳性的基底样乳腺癌 MDA-MB-468 细胞，并建立皮下肿瘤模型，通过体外细胞摄取、在体SPECT显像、小动物PET显像和生物分布研究验证其在体内外的靶向特异性。
结果：经木瓜蛋白酶酶切后，得到大小约50kDa的抗体Fab片段，细胞免疫荧光和流式细胞术结果证实，其在体外可与 MDA-MB-468 细胞特异性结合，且与完整单克隆抗体Cetuximab相比，亲和活性没有明显变化。99mTc-HYNIC-Cetuximab-Fab标记率为64%-87%，放化纯 92.37 ± 4.88%。68Ga-L-NETA-Tz 标记率>95%， 68Ga-L-NETA-Cetuximab-Fab标记率约为80%，放化纯>99%。二者在体外均可被MDA-MB-468细胞摄取，并随时间的延长摄取率逐渐增高，最高分别可达8.71 ± 1.04%（99mTc，6h）和12.35 ± 0.19%（68Ga，2h），给予过量阻断剂后，细胞摄取率显著降低。SPECT平面静态显像、小动物PET静态显像及生物分布研究结果表明，MDA-MB-468肿瘤可见明显摄取，99mTc和 68Ga标记的Fab片段摄取值最高分别为6.46 ± 0.5% ID/g（6h）和5.07 ± 0.2%ID/g（2h），均可被过量的Cetuximab阻断（2.71 ± 0.03%ID/g，2.25 ± 0.16%ID/g，P<0.01）。此外，肝脏和肾脏对探针摄取较高，但随着时间的延长，肝脏摄取逐渐降低。
结论：99mTc和 68Ga标记的EGFR抗体Fab片段可在体内外特异性结合EGFR，有望成为基底样乳腺癌放射免疫显像的显像剂。
第二部分 靶向EGFR西妥昔单抗预定位PET显像用于基底样乳腺癌放射免疫显像的初步研究
目的：乳腺癌位居女性癌症发病率首位，严重威胁女性身心健康，其中基底样乳腺癌（BLBC）具有特殊的生物学行为，预后较差，而EGFR高表达在大多数BLBC的发生发展中起重要作用。放射免疫显像是核医学显像常用的肿瘤显像技术之一，但是因为单克隆抗体分子量大、体内循环时间长，而不适合半衰期短的核素（如18F、68Ga等）。预定位技术通过预先将抗体注入体内，经过合适的时间后，使抗体聚集于肿瘤组织，同时在血液和非靶器官组织中清除，随之注射短半衰期核素标记小分子化合物，使其在体内与抗体特异性结合，从而增加了放射性药物在肿瘤部位的浓聚，显著提高了肿瘤靶/非靶（T/NT）比值。本研究采用预定位技术，利用“点击化学”原理，探索西妥昔单抗（Cetuximab）靶向EGFR的特异性及在基底样乳腺癌PET放射免疫显像中的应用价值。
方法：通过TCO-NHS修饰Cetuximab获得Cetuximab-TCO。以L-NETA为螯合剂，制备 68Ga-L-NETA-Tz分子探针，通过radio-HPLC测定标记率、体外稳定性等性质。体外培养人源性基底样乳腺癌细胞MDA-MB-468、MDA-MB-231，并用western blot对两种细胞的EGFR表达进行鉴定。细胞摄取及阻断等体外实验探讨探针的体外靶向性及预定位技术的可行性。建立上述两种细胞系的皮下荷瘤鼠模型。提前将 50μg Cetuximab-TCO注入荷瘤鼠体内，经过不同时间（48、36、24和12h）后注入150μCi 68Ga-L-NETA-Tz，利用“点击化学”方法 TCO-Tz 的反应实现 68Ga-L-NETA-Tz 与Cetuximab-TCO的体内连接。进行小动物PET显像，并结合生物分布获取该探针的在体药代动力学特性及肿瘤靶向特异性。
结果：成功制备 68Ga-L-NETA-Tz分子探针，标记率>95%。将此探针置于胎牛血清中37℃孵育2h后大部分仍以原形式存在，放化纯>95%。细胞western blot及肿瘤组织免疫组织化学结果显示MDA-MB-468的EGFR表达水平高于MDA-MB-231。体外细胞摄取实验表明，虽抗体内化随时间延长逐渐增加，但细胞表面仍有部分结合位点，证实预定位技术的可行性。体内PET显像及生物分布结果表明，以提前注射36h显像效果最好，达到最高的肿瘤摄取值及最佳靶/非靶比值。MDA-MB-468 肿瘤组织摄取较高（0.77 ± 0.05%ID/g，1h），肿瘤/肌肉为4.67 ± 0.46。给予过量Cetuximab的阻断组、未提前注入Cetuximab-TCO的对照组及MDA-MB-231阴性对照组肿瘤未见明显摄取。
结论：采用预定位技术，通过先后注射Cetuximab-TCO和 68Ga-L-NETA-Tz，使两者在适合的时间在体内特异性结合，达到应用短半衰期核素进行分子量较大抗体放射免疫显像的目的，肿瘤组织浓聚明显。68Ga-L-NETA-Tz与Cetuximab-TCO预定位技术可以探测体内EGFR的表达，为基底样乳腺癌的PET显像提供了新手段。
目的：本研究旨在利用核素 99mTc 和 68Ga 标记靶向 EGFR 单克隆抗体西妥昔单抗（Cetuximab）的抗原结合片段（Fab），评估其用于基底样乳腺癌放射免疫显像的可行性。
方法：对完整单克隆抗体Cetuximab用固定化木瓜蛋白酶酶切得到Cetuximab-Fab片段，SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）蛋白电泳检测其分子量，经细胞免疫荧光和流式细胞术检测其特异性和亲和活性。抗体Fab片段分别通过SHNH和L-NETA及TCO-Tz的“点击化学”反应标记放射性核素 99mTc和 68Ga。选择EGFR表达阳性的基底样乳腺癌 MDA-MB-468 细胞，并建立皮下肿瘤模型，通过体外细胞摄取、在体SPECT显像、小动物PET显像和生物分布研究验证其在体内外的靶向特异性。
结果：经木瓜蛋白酶酶切后，得到大小约50kDa的抗体Fab片段，细胞免疫荧光和流式细胞术结果证实，其在体外可与 MDA-MB-468 细胞特异性结合，且与完整单克隆抗体Cetuximab相比，亲和活性没有明显变化。99mTc-HYNIC-Cetuximab-Fab标记率为64%-87%，放化纯 92.37 ± 4.88%。68Ga-L-NETA-Tz 标记率>95%， 68Ga-L-NETA-Cetuximab-Fab标记率约为80%，放化纯>99%。二者在体外均可被MDA-MB-468细胞摄取，并随时间的延长摄取率逐渐增高，最高分别可达8.71 ± 1.04%（99mTc，6h）和12.35 ± 0.19%（68Ga，2h），给予过量阻断剂后，细胞摄取率显著降低。SPECT平面静态显像、小动物PET静态显像及生物分布研究结果表明，MDA-MB-468肿瘤可见明显摄取，99mTc和 68Ga标记的Fab片段摄取值最高分别为6.46 ± 0.5% ID/g（6h）和5.07 ± 0.2%ID/g（2h），均可被过量的Cetuximab阻断（2.71 ± 0.03%ID/g，2.25 ± 0.16%ID/g，P<0.01）。此外，肝脏和肾脏对探针摄取较高，但随着时间的延长，肝脏摄取逐渐降低。
结论：99mTc和 68Ga标记的EGFR抗体Fab片段可在体内外特异性结合EGFR，有望成为基底样乳腺癌放射免疫显像的显像剂。
第二部分 靶向EGFR西妥昔单抗预定位PET显像用于基底样乳腺癌放射免疫显像的初步研究
目的：乳腺癌位居女性癌症发病率首位，严重威胁女性身心健康，其中基底样乳腺癌（BLBC）具有特殊的生物学行为，预后较差，而EGFR高表达在大多数BLBC的发生发展中起重要作用。放射免疫显像是核医学显像常用的肿瘤显像技术之一，但是因为单克隆抗体分子量大、体内循环时间长，而不适合半衰期短的核素（如18F、68Ga等）。预定位技术通过预先将抗体注入体内，经过合适的时间后，使抗体聚集于肿瘤组织，同时在血液和非靶器官组织中清除，随之注射短半衰期核素标记小分子化合物，使其在体内与抗体特异性结合，从而增加了放射性药物在肿瘤部位的浓聚，显著提高了肿瘤靶/非靶（T/NT）比值。本研究采用预定位技术，利用“点击化学”原理，探索西妥昔单抗（Cetuximab）靶向EGFR的特异性及在基底样乳腺癌PET放射免疫显像中的应用价值。
方法：通过TCO-NHS修饰Cetuximab获得Cetuximab-TCO。以L-NETA为螯合剂，制备 68Ga-L-NETA-Tz分子探针，通过radio-HPLC测定标记率、体外稳定性等性质。体外培养人源性基底样乳腺癌细胞MDA-MB-468、MDA-MB-231，并用western blot对两种细胞的EGFR表达进行鉴定。细胞摄取及阻断等体外实验探讨探针的体外靶向性及预定位技术的可行性。建立上述两种细胞系的皮下荷瘤鼠模型。提前将 50μg Cetuximab-TCO注入荷瘤鼠体内，经过不同时间（48、36、24和12h）后注入150μCi 68Ga-L-NETA-Tz，利用“点击化学”方法 TCO-Tz 的反应实现 68Ga-L-NETA-Tz 与Cetuximab-TCO的体内连接。进行小动物PET显像，并结合生物分布获取该探针的在体药代动力学特性及肿瘤靶向特异性。
结果：成功制备 68Ga-L-NETA-Tz分子探针，标记率>95%。将此探针置于胎牛血清中37℃孵育2h后大部分仍以原形式存在，放化纯>95%。细胞western blot及肿瘤组织免疫组织化学结果显示MDA-MB-468的EGFR表达水平高于MDA-MB-231。体外细胞摄取实验表明，虽抗体内化随时间延长逐渐增加，但细胞表面仍有部分结合位点，证实预定位技术的可行性。体内PET显像及生物分布结果表明，以提前注射36h显像效果最好，达到最高的肿瘤摄取值及最佳靶/非靶比值。MDA-MB-468 肿瘤组织摄取较高（0.77 ± 0.05%ID/g，1h），肿瘤/肌肉为4.67 ± 0.46。给予过量Cetuximab的阻断组、未提前注入Cetuximab-TCO的对照组及MDA-MB-231阴性对照组肿瘤未见明显摄取。
结论：采用预定位技术，通过先后注射Cetuximab-TCO和 68Ga-L-NETA-Tz，使两者在适合的时间在体内特异性结合，达到应用短半衰期核素进行分子量较大抗体放射免疫显像的目的，肿瘤组织浓聚明显。68Ga-L-NETA-Tz与Cetuximab-TCO预定位技术可以探测体内EGFR的表达，为基底样乳腺癌的PET显像提供了新手段。