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研究背景黑素瘤（melanoma）是一种黑素细胞来源的高度恶性肿瘤,发病原因尚不十分清楚,可能与色素痣、遗传因素、紫外线照射等有关,其潜在的分子机制尚未完全明了。常用的治疗手段有手术、放疗、化疗和免疫治疗等,但效果不尽人意。随着对肿瘤代谢研究的不断深入,人们发现解偶联蛋白2（Uncoupling protein2,UCP2）的过表达与肿瘤的发生发展关系密切,然而UCP2与黑素瘤的相关性尚不清楚。雷公藤红素（Celastrol,CEL）是一种提自中药雷公藤根皮具有多种生物活性的天然产物。既往研究表明,雷公藤红素可调解参与肿瘤发生发展的多种分子靶点,但雷公藤红素是否对黑素瘤UCP2表达有影响尚缺乏研究。此外,雷公藤红素水溶性差,生物利用度低,必须加大剂量才能改善治疗效果。但随着剂量的增加,肝毒性和肾毒性等副作用也随之出现。故开发新的药物递送技术来降低严重不良反应从而改善药效就显得尤为重要。基于以上研究背景,我们进行了如下研究。第一部分解偶联蛋白2在黑素瘤组织中的表达及意义目的检测UCP2在黑素瘤组织中的表达情况,探讨其与皮肤黑素瘤临床病理特征的相关性,为研究黑素瘤的发病机制和寻找特异有效的诊断治疗靶点提供新的思路。方法通过免疫组织化学方法检测49例正常皮肤、51例复合痣及65例皮肤黏膜黑素瘤组织中UCP2的表达情况,并分析UCP2与皮肤黑素瘤临床病理特征的相关性。结果UCP2在正常皮肤组织几乎不表达,复合痣表达很低,黑素瘤组织阳性表达占76.9%,显著高于复合痣和正常皮肤（P<0.001）;UCP2的表达与患者年龄、性别、淋巴细胞浸润程度、有无溃疡无关（P>0.05）,但与肿瘤Clark分级和Breslow厚度有关（P<0.05）。结论UCP2在黑素瘤组织中的表达显著高于正常皮肤和复合痣,且与肿瘤Clark分级和Breslow厚度有关,推测UCP2高表达可能在黑素瘤的发生发展中起重要作用,在一定程度上提示肿瘤具有更高的恶性程度和侵袭性。第二部分解偶联蛋白2与黑素瘤的相关性及机制研究目的探讨抑制UCP2表达与黑素瘤生物学行为、氧化应激、细胞代谢、化疗耐药改变的相关性及可能的信号传导通路。方法1.采用UCP2短发夹RNA（shRNA）慢病毒质粒表达载体和随机对照质粒表达载体,转染黑素瘤A375细胞株和黑素瘤SK-Mel-28细胞株,构建UCP2稳定下调的黑素瘤细胞株。2.抑制UCP2表达对黑素瘤细胞生物学行为的影响通过Incucyte Essen检测对黑素瘤增殖能力的影响;通过Woundhealing细胞划痕实验和Transwell细胞侵袭实验检测对黑素瘤迁移侵袭能力的影响;通过3D培养检测对黑素瘤成瘤能力的影响。3.抑制UCP2表达对黑素瘤细胞氧化应激及细胞代谢的影响采用试剂盒检测对黑素瘤细胞H2O 2水平、线粒体膜电位、ATP和乳酸盐生成的影响。4.通过MTT法检测抑制UCP2表达对黑素瘤化疗耐药的影响。5.通过Western blot方法检测抑制UCP2表达对AKT/mTOR和MAPK/ERK信号传导通路的影响。结果1.Western blot证实每个细胞系各得到两株UCP2稳定下调的阳性克隆（KD）、一株转染随机对照质粒表达载体的对照组细胞（LC）。2.抑制UCP2表达对黑素瘤细胞生物学行为的影响黑素瘤A375和黑素瘤SK-Mel-28两株KD细胞的增殖能力明显低于LC细胞（P<0.05）;Woundhealing细胞划痕实验,黑素瘤A375和黑素瘤SK-Mel-28两株KD细胞的划痕宽度明显大于LC细胞（P<0.05）;Transwell细胞侵袭实验,黑素瘤A375和黑素瘤SK-Mel-28两株KD细胞侵袭细胞数目明显少于LC细胞;3D成瘤实验,黑素瘤SK-Mel-28两株KD细胞成瘤体积小于LC细胞球状体体积（P<0.05）,黑素瘤A375细胞,一株KD细胞的成瘤体积小于LC细胞,而另一株KD细胞的成瘤体积大于LC细胞,但密度小于LC细胞球状体的密度（P<0.05）。3.抑制UCP2表达对黑素瘤细胞氧化应激及细胞代谢的影响黑素瘤A375和黑素瘤SK-Mel-28两株KD细胞H2O2水平、ATP产量、乳酸盐生成水平明显低于LC细胞（P<0.05）;线粒体膜电位明显高于LC细胞（P<0.05）。4.抑制UCP2表达对黑素瘤化疗耐药的影响随着顺铂浓度的增加,黑素瘤A375和SK-Mel-28 KD细胞存活率有降低趋势。当顺铂在1.67mM、5mM的浓度下,作用细胞48 h,黑素瘤A375和SK-Mel-28两株KD细胞存活率明显低于LC细胞（P<0.05）。5.抑制UCP2表达对黑素瘤细胞信号传导通路的影响（1）AKT/mTOR通路黑素瘤A375和黑素瘤SK-Mel28两株KD细胞的磷酸化AKT、磷酸化p70S6K、磷酸化4E-BP1蛋白表达水平明显低于LC细胞（P<0.05）。（2）MAPK/ERK通路黑素瘤A375和黑素瘤SK-Mel-28两株KD细胞的磷酸化ERK蛋白表达水平明显低于LC细胞（P<0.05）。结论采用UCP2短发夹RNA（shRNA）慢病毒质粒表达载体能有效抑制UCP2表达。抑制UCP2表达,可以抑制黑素瘤细胞的增殖、迁移侵袭及成瘤能力,改变黑素瘤细胞的生物学行为;影响黑素瘤细胞氧化应激及细胞代谢;提高黑素瘤对化疗药物顺铂的敏感性;下调AKT/mTOR和MAPK/ERK信号传导通路的活性,UCP2有望成为治疗黑素瘤的有效靶点。第三部分雷公藤红素载药纳米粒子对黑素瘤的抑制作用目的通过构建新型治疗黑素瘤的雷公藤红素载药纳米粒子（CEL-NPs）,从体内和体外水平研究其对黑素瘤的抑制作用、安全性以及对黑素瘤模型组织中UCP2表达的影响,为临床治疗黑素瘤提供一种新方法。方法1.采用一步“化学键合诱导自组装”方法制备雷公藤红素载药纳米粒子（CEL-NPs）;通过核磁共振氢谱、紫外-可见分光光度计验证是否成功合成,并计算出载药量（DLC）和载药效率（DLE）;通过溶解性考察、血清稳定性检测、透射电镜观察粒子形态、动态光散射仪测定力学半径验证是否达到预期效果;高效液相色谱法测定药物体外释放模式。2.体外实验（1）通过流式细胞术（FCA）和激光共聚焦（CLSM）检测B16F10鼠黑素瘤细胞对CEL-NPs的摄取情况。（2）通过MTT检测CEL-NPs、CEL和mPEG-PLL对B16F10鼠黑素瘤细胞的杀伤作用以及mPEG-PLL的安全性。3.体内实验（1）构建B16F10鼠黑素瘤动物模型,检测mPEG-PLL(22 mg kg-1)、CEL(4 mg kg-1或2 mg kg-1)、CEL-NPs(4 mg kg-1或2 mg kg-1)不同组别对黑素瘤的抑制作用,并观察小鼠体重变化。（2）通过离体荧光成像评估CEL-NPs的体内分布。（3）通过组织病理学改变比较CEL-NPs与CEL在体内抗肿瘤效果以及对主要器官的毒性反应。（4）采用免疫组织化学方法检查CEL-NPs与CEL对B16F10鼠黑素瘤模型组织中UCP2表达的影响。结果1.成功组装了CEL-NPs,载药量（DLC）和载药效率（DLE）分别为9.95 wt%和53.9%;具有良好的溶解性及稳定性;具有球形结构,尺寸约为103.1±10.7 nm,流体动力学半径（Rh）为65±6.4 nm;在体外呈持续缓慢释放模式。2.体外试验（1）通过FCA和CLSM观察CEL-NPs可以被B16F10细胞有效地内吞。（2）MTT法检测结果作用细胞24 h、48 h,CEL-NPs对鼠黑素瘤B16F10细胞的杀伤效果接近于CEL。作用48 h,CEL-NPs和CEL的IC50值分别为2.81mM(1.26mg ml-1)和3.56mM(1.60mg ml-1),mPEG-PLL对鼠黑素瘤细胞B16F10几乎无杀伤作用。3.体内试验（1）抑瘤试验低剂量CEL组肿瘤抑制率明显高于mPEG-PLL组（P<0.001）;相同剂量,CEL-NPs组的抑瘤率高于CEL组（P<0.001）;高剂量CEL-NPs（或CEL）组的肿瘤抑制率优于低剂量组（P<0.05或P<0.001）。治疗过程中CEL-NPs组体重与对照组和mPEG-PLL组相近,无统计学差异（P>0.05）。相同剂量,游离CEL组与CEL-NPs组比较,体重明显减轻（P<0.05）。（2）离体荧光成像CEL-NPs-Cy5注射至鼠黑素瘤模型体内,3 h和10 h比较,肿瘤的荧光强度几乎没有变化（P>0.05）。（3）组织病理学检查CEL-NPs组坏死面积比游离CEL组广泛;游离CEL组肝脏和肾脏均有不同程度病理改变,对照组和CEL-NPs组未观察到器官的超微结构变化。（4）免疫组织化学结果高剂量CEL-NPs和高剂量CEL组治疗的黑素瘤模型组织中UCP2蛋白表达明显低于对照组（P<0.05）。结论成功合成了CEL-NPs,具有良好的溶解性、稳定性及缓慢释放特点。在体内外对黑素瘤均有明显的抑制作用,安全性高,且能降低黑素瘤模型组织中UCP2表达水平,为临床应用奠定了理论基础。