研究背景脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是世界范围的难治性疾病,可引起轴突损伤和神经元死亡,导致损伤节段以下截瘫及括约肌功能障碍,严重损害患者的生存质量,加重患者的经济负担。由于损伤局部不利环境的影响,如局部神经炎症、缺血、脂质体过氧化、胶质瘢痕形成等,脊髓神经的修复再生极其有限。目前为止对于脊髓损伤的治疗还没有一种十分安全有效的的方法。当前,细胞治疗方兴未艾,骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)是细胞移植疗法的重要一员,但BMSCs在治疗脊髓损伤时的作用受到神经炎症等局部不利微环境的极大限制。而近年来的研究发现,脑多巴胺能神经营养因子(cerebral dopamine neurotrophic factor, CDNF)能够保护6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的中脑神经元损害,并且能够显著促进中脑神经元功能的恢复；在大鼠坐骨神经离断损伤模型中的研究发现CDNF局部过表达能够促进神经轴突的再生和下肢功能的恢复。在中枢神经系统中,小胶质细胞是重要的免疫细胞,是引起神经炎症与损伤的主要介导细胞,我们前期研究提示CDNF能够减轻小胶质细胞的炎症损伤。尽管CDNF的作用机制,包括其受体和涉及的信号通路尚不清楚,但它所展现的抗炎作用和神经保护作用为脊髓损伤后的的修复再生和功能恢复带来了新的研究思路和方向。研究目的本研究旨在构建携带CDNF基因的慢病毒载体,建立由该慢病毒转染的BMSCs细胞治疗载体,使BMSCs具备稳定的表达分泌CDNF的能力.探讨这种细胞移植疗法对脊髓挫伤后的组织形态和功能修复的影响,探索CDNF对神经纤维再生、局部神经炎症、脊髓损伤微环境的作用及其机制。体外实验部分重点探讨CDNF在小胶质细胞炎症模型中的抗炎作用和对细胞炎症损伤的保护作用,以及可能涉及的信号转导通路等分子机制研究。研究方法本研究由两部分构成：第一部分：构建慢病毒表达质粒plenti-CDN F,将表达质粒与相应包装质粒共转染293T细胞,生产携带CDNF基因的重组慢病毒；培养并鉴定BMSCs,建立慢病毒载体转染BMSCs的方法,通过流式细胞术(flow cytometry, FCM)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白质免疫印迹实验(Western blot)检测慢病毒的转染效率及CDNF的表达与分泌。制作大鼠脊髓挫伤动物模型,随机分为4组：CDNF转染的BMSCs移植组(CDNF-BMSCs 组)、空病毒载体对照组(Vehicle-BMSCs组)、脊髓损伤对照组(SCI组)和假手术组(Sham组)。Sham组仅切除椎板不打击脊髓。将CDNF转染的BMSCs在脊髓损伤处进行细胞移植,观察该疗法对损伤脊髓微环境、局部神经炎症的调节及对脊髓神经纤维再生和脊髓功能恢复的影响。行为功能学观察：大鼠后肢运动功能BBB评分(Basso, Beattie and Bresnahan scale)和BBB亚组评分(BBB subscore scale)、水平梯行走实验(horizontal ladder walking)评价脊髓功能恢复情况；生物化学检测：免疫组织化学染色观察BMSCs移植后存活情况,ELISA检测损伤脊髓处CDNF蛋白表达,RT-PCR检测损伤局部的炎性介质mRNA表达水平；组织形态学观察：应用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)逆行追踪技术检测皮质脊髓束再生情况；免疫组化法检测神经微丝蛋白(neurofilaments,NFs)的表达水平变化,观察神经轴突再生情况；透射电镜观察脊髓损伤处亚细胞结构以及神经轴突和髓鞘的再生情况。第二部分：使用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作为炎症诱导剂建立体外培养的小胶质细胞炎症模型,Western blot检测不同浓度的LPS诱导的小胶质细胞炎症状态下CDN F蛋白水平的变化；再设置不同浓度的CDNF干预组及对照组,使用ELISA法检测CDNF对LPS诱导的小胶质细胞分泌炎症介质和炎性细胞因子水平的影响；通过LDH细胞毒性检测试剂盒测定CDNF对小胶质细胞炎症损伤的保护效果。为了探索CDNF发挥以上作用的内在机制,我们还检测了CDNF对小胶质细胞体外炎症模型中MAPKs信号通路,包括JNK、P38和ERK1/2等分子信号的影响。研究结果第一部分：首先,流式细胞术、Western blot、ELIS A等研究结果表明成功构建了plenti-CDNF慢病毒转染的BMSCs用于大鼠脊髓挫伤模型的细胞移植治疗。大鼠后肢运动功能评分结果表明,细胞移植治疗后3周至6周,CDNF-BMSCs移植组脊髓功能恢复情况显著优于Vehicle-BMSCs组和SCI组。组织学切片观察发现,细胞移植治疗6周后,CDNF-BMSCs移植组的损伤处脊髓空洞显著小于SCI组和Vehicle-BMSCs组；免疫组化和脊髓HRP逆行追踪等结果显示,CDNF-BMSCs移植组脊髓神经轴突再生情况优于SCI组和Vehicle-BMSCs组；电子显微镜扫描结果与此一致,发现CDNF-BMSCs移植组脊髓损伤处神经轴突再生和髓鞘再生情况优于SCI组和Vehicle-BMSCs组；我们还发现CDNF-BMSCs移植组干细胞存活率高于Vehicle-BMSCs组,这可能与CDNF抑制损伤局部神经炎症有关。干细胞移植后CDNF的局部表达有效抑制了炎性介质的释放和神经炎症的发生,改善了脊髓损伤的局部微环境,促进了干细胞的存活及脊髓损伤的再生修复。第二部分：我们的研究结果表明,在小胶质细胞的体外炎症模型中,LPS刺激可引起小胶质细胞的CDNF水平上调。我们在后续实验中发现,CDNF能够显著抑制小胶质细胞炎症模型中炎性介质的分泌；LDH细胞毒性检测表明CDNF预处理能够减轻LPS诱导的小胶质细胞的炎症损伤。为了探讨CDNF发挥其抗炎作用的机制,我们检测了CDNF干预对小胶质细胞炎症模型中MAPKs (JNK/P38/ERK)信号通路的影响。Western blot结果显示CDNF干预可以抑制小胶质细胞中JNK信号磷酸化,说明CDNF可能通过抑制JNK信号通路而抑制细胞炎症。此外我们还检测了同等实验条件下P38和ERK的磷酸化水平,结果表明不同浓度的CDNF干预对LPS诱导的p-P38/P38, p-ERK/ERK水平变化无明显影响,说明CDNF对细胞炎症的调节不是通过P38或ERK信号通路进行的。研究结论第一部分：我们发现CDNF慢病毒转染的BMSCs移植能促进大鼠脊髓损伤后的修复。研究结果显示,CDNF-BMSCs组大鼠后肢感觉运动功能评分、脊髓损伤修复、神经轴突再生情况显著优于Vehicle-BMSCs组,说明干细胞移植后CDNF在局部的持续稳定的表达对损伤后修复起到了关键作用,降低了炎性介质的表达水平,抑制了脊髓损伤后的局部神经炎症,改善了损伤部位的微环境,为神经修复和再生提供了有利条件。CDNF慢病毒转染的BMSCs移植疗法为脊髓损伤提供了新的具有潜力的治疗方案。第二部分：在体外培养的小胶质细胞炎症模型中,发现LPS刺激可引起小胶质细胞的CDNF表达水平上调,提示CDNF可能对小胶质细胞的炎症过程起到调节作用。进一步实验表明,CDNF能够抑制LPS诱导的小胶质细胞炎性介质的释放并减轻小胶质细胞的炎症损伤。对LPS刺激的小胶质细胞炎症模型中MAPKs信号通路的检测发现,CDNF干预能够显著降低JNK信号的磷酸化水平,而对P38和ERK信号无明显影响,说明CDNF的抗炎作用以及对小胶质细胞的保护作用是通过抑制JNK通路的活化实现的,而并不通过P38和ERK通路。