【摘 要】
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农杆菌介导人源轮状病毒抗原蛋白GIVP4和G2VP4基因花生(Arachis hypoaea L.)是世界范围内的一种重要的油料经济作物,含有丰富的蛋白质和其他营养物质,其蛋白质含量可达25﹪.同
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农杆菌介导人源轮状病毒抗原蛋白GIVP4和G2VP4基因花生(Arachis hypoaea L.)是世界范围内的一种重要的油料经济作物,含有丰富的蛋白质和其他营养物质,其蛋白质含量可达25﹪.同时花生贮藏期长,生产规模不受限制,因此花生是生产口服基因工程疫苗的理想载体.
本研究所用农杆菌菌株为LBA 4404.质粒为双价表达载体pBI121,含35SCaMV启动子连接的人源轮状病毒抗原蛋白VP4基因(2350bp)和新霉素磷酸转移酶NPTⅡ基因,即以卡那霉素(Kan)抗性基因作为抗性筛选基因.研究选用了花育23号和鲁花14号2个花生栽培品种,以子叶为外植体建立和完善了子叶再生体系,研究发现在6-BA 5.00mg/L.、2,4-D 1.50mg/L的芽诱导培养基里,花育23号和鲁花14号子叶外植体丛生芽诱导率均最高,分别达89.67﹪和83.33﹪,子叶再生体系是目前比较理想的花生转化体系.
研究影响子叶再生体系转化效率的因素表明,当菌液OD<,600>为0.5-0.7、侵染时间10min、共培养时间3d、每50ml菌液添加烟草提取物1.0ml可获得较好的转化效果.对抗生素浓度对芽分化率的影响研究发现,当头孢霉素(Ce0250mg/L、羧苄青霉素(Carb)250-500mg/L时,效果最好,不但可以完全抑制农杆菌生长,而且有较高的芽诱导率.
本研究对抗Kan的植株进行了PCR检测、Southern杂交、RT-PCR分子生物学技术检测,证实了人源轮状病毒抗原蛋白G1VP4和G2VP4基因已经整合到了花生栽培品种鲁花14号和花育23号的基因组DNA中.
选取26株表现Kan抗性的花生植株进行.NPTⅡ基因的PCR.检测,经1﹪琼脂糖凝胶电泳分析,结果有22株能扩增出620bp左右的.NPTⅡ基因条带,阳性率约为84.62﹪,提取NPTⅡ基因显示为阳性的植株叶片DNA作模板,用VP4基因特异引物进行PCR扩增,所有NPTⅡ基因阳性的植株均扩增出了约2350bp的特异性条带,而野生型没有,初步证明VP4基因已整合到花生基因组中.
对部分转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析,结果发现部分转基因植株中出现了阳性杂交信号,这表明VP4基因的确已经整合到花生的基因组中,并且是单拷贝.用RT-PCR分析了11株转G1VP4基因的植株,结果表明插入鲁花14号中的VP4基因已经正常转录.
以花生为生物反应器开展口服疫苗研制是完全可行的,本研究利用花生基因工程表达系统生产轮状病毒口服疫苗的前期产物重组抗原蛋白,为将来进一步研制抗病毒口服疫苗奠定基础,具有较高的实践价值和研究价值.研制成功,不仅使婴幼儿免受由人源轮状病毒(human rotavirus,HRV)引起的腹泻危害,降低患者的死亡率和治病费用,还可以为我国在利用植物生物反应器生产人体疫苗方面积累宝贵的经验.
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