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化学农药的广泛使用对农业发展和粮食安全起了重要作用,但是由于害虫抗药性的发展,防治抗药性害虫正变得越来越困难。苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis (Bt)由于其杀虫晶体蛋白(ICPs)具有高度专一性,对人畜和非靶标昆虫非常安全而被广泛用于防治小菜蛾等鳞翅目害虫。小菜蛾Plutella xvlostella是一种全球性分布的蔬菜害虫,早在1990年就有田间小菜蛾种群对Bt制剂产生抗性的报道,但迄今为止,小菜蛾对Bt抗性的分子机理还是没有研究清楚。为了研究我国小菜蛾对Cry1Ac的抗性机理,首先在室内筛选获得一个高抗品系(SZBT),并用F1筛选法检测了3个小菜蛾田间种群Cry1Ac抗性基因的频率；通过蛋白组学方法,对小菜蛾CryAc抗性和敏感品系幼虫中肠毒素结合蛋白进行分离和鉴定,发现一种Bt毒素受体—氨肽酶N蛋白(PxAPN2)在抗性品系中表达量明显低于敏感品系；然后,克隆了小菜蛾PxAPN2基因,并采用RNAi技术明确了PxAPN2基因在小菜蛾对Cry1Ac抗性产生中的作用。明确小菜蛾对Bt毒素Cry1Ac抗性的生化和分子机理对于小菜蛾Bt抗性治理具有重要意义。1.小菜蛾Cry1Ac抗性遗传互补与田间种群Cry1Ac抗性基因频率检测由于Bt制剂的大量使用,我国小菜蛾田间种群对Cry1Ac已产生了不同程度的抗性。由于小菜蛾对Cry1Ac抗性为不完全隐性遗传,检测抗性基因频率对于制定抗性治理措施尤为重要。通过室内筛选获得对Cry1Ac抗性达2000倍左右的SZBT品系,该品系对CrylAc的抗性表现为Ⅰ型(Mode 1)。抗性遗传互补试验表明,SZBT品系与来自美国的Cry1Ac-R抗性品系对Cry1Ac的抗性由相同遗传位点控制。将2008年采自广东广州、惠州及云南玉溪的田间小菜蛾分别于SZBT进行单对杂交,通过检测120个单对杂交后代(F1)在CrylAc区分剂量(2μg/mL)下的死亡率,测得这3个田间种群Cry1Ac抗性基因频率分别为0.375、0.472和0.156。广州、惠州和玉溪田间种群对Cry1Ac的抗性分别为73、117和13倍,抗性程度与其抗性基因频率相一致。2.小菜蛾中肠Cry1Ac结合蛋白的分离与鉴定用生物素标记的CrylAc分别与敏感品系ROTH、抗性品系SZBT和对照品系SZ小菜蛾4龄幼虫中肠BBMV(用传统的SDS-PAGE分离)进行配基结合试验,发现Cry1Ac结合蛋白有10条主带。小菜蛾SZBT抗性品系110 kDa结合蛋白表达量低于敏感品系,而其他结合蛋白表达量差异不明显。据此推测,110 kDa的Cry1Ac结合蛋白可能为Cry1Ac的功能受体,其表达量下降可能与SZBT品系对Cry1Ac抗性相关。为了进一步分离和鉴定Cry1Ac结合蛋白,用2-D电泳和配基结合方法对小菜蛾抗性品系(SZBT)和敏感品系(ROTH)中肠BBMV中Cry1Ac结合蛋白进行分离,并通过肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF)对主要结合蛋白进行鉴定。鉴定的小菜蛾Cry1Ac结合蛋白包括氨肽酶N(PxAPN2)、储存蛋白(storage protein)、肌动蛋白(actin)、硫酸酯酶(glucosinolate sulfatase)、V-ATPase亚基B (vacuolar ATPase B subunit)等。小菜蛾SZBT抗性品系中PxAPN2表达量明显低于敏感品系的相应结合蛋白,该PxAPN2(分子量为110 kDa)可能即为1-D电泳所发现的在抗性品系中表达量降低的110 kDa结合蛋白。氨肽酶N是鳞翅目昆虫中肠BBMV上Cry1Ac毒素的重要受体,小菜蛾PxAPN2蛋白的表达量降低可能与抗性品系Cry1Ac抗性相关。3.小菜蛾PxAPN2基因沉默后对Cry1Ac敏感性的影响采用RT-PCR技术分别克隆了抗性(SZBT)和敏感(ROTH)品系中编码110kDaCry1Ac结合蛋白的氨肽酶N基因(PxAPN2)。抗性和敏感品系PxAPN2基因间有多个位点的氨基酸发生替换。用实时定量PCR比较PxAPN2基因在小菜蛾SZBT和ROTH品系四龄幼虫中肠中的mRNA表达量,发现SZBT抗性品系PxAPN2 mRNA表达量下降为ROTH敏感品系的33.9%。为了证明小菜蛾PxAPN2在CryAc抗性形成中的作用,采用RNAi技术使PxAPN2基因mRNA表达下调,研究PxAPN2下调能否使小菜蛾敏感品系对Cry1Ac获得抗性。通过喂食体外合成的PxAPN2 dsRNA干扰小菜蛾ROTH敏感品系PxAPN2基因的表达,结果表明喂食PxAPN2 dsRNA最高可以使PxAPN2基因mRNA表达量下降53%,而另一种氨肽酶N基因(APNA) mRNA表达量则没有明显变化。小菜蛾PxAPN2基因被沉默后使ROTH敏感品系幼虫对Cry1Ac产生4-14倍抗性。上述结果表明,小菜蛾PxAPN2是Cry1Ac的功能受体,其表达量降低导致小菜蛾对CryAc产生抗性。本研究运用蛋白组学、配基结合、基因克隆和基因沉默等技术,系统研究了小菜蛾对Bt毒素Cry1Ac抗性的生化和分子机理,证明了PxAPN2为小菜蛾幼虫中肠中Cry1Ac的功能受体,该受体mRNA和蛋白表达量下降能够导致小菜蛾对Cry1Ac产生高水平抗性。由于该基因位点与Cry1Ac抗性基因并不位于同一连锁群,PxAPN2 mRNA表达下调可能与反式作用因子有关,PxAPN2蛋白表达量下降也可能与转录后调控有关,确切原因还有待进一步研究。