香蕉(musa nana Lour.)是芭蕉科芭蕉属多年生大型常绿草本植物,分布于热带、亚热带100多个国家,但在大部分地区,香蕉常年都受到冬春寒流的侵袭,轻则香蕉叶、果受伤而减产,重则整株死亡。因此,研究香蕉产生寒害的机理,提高香蕉的抗寒力,在理论研究和生产实践中都具有重大的意义。为解析香蕉寒害的分子机制,分别运用抑制差减杂交技术(SSH)和蛋白双向电泳技术,通过生物信息学,对低温胁迫过程中的某些特异表达的基因、蛋白进行系统研究。应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractivehybridization, SSH)成功构建了低温胁迫下香蕉叶片与自然生长条件叶片差异表达的cDNA消减文库。经蓝、白斑筛选,共得到了142个阳性克隆。菌落PCR分析结果表明,95%左右的阳性克隆含有大小200～700 bp的插入片段。随机选取20个克隆进行了测序,并用基因检索工具(Genbank)对获得的EST进行了Blastx分析,结果表明,8个EST属于无任何序列线索的未知序列,4个属于未知功能的推测蛋白基因,2个属于未知功能的蛋白基因,3个与已知功能基因具有较高的同源性。应用半定量PCR技术,对编号28片段进行的表达分析结果表明,该片段为低温胁迫特异表达基因,在低温胁迫处理后10-24h范围内随处理时间的增加而表达量增强,自然条件下生长的香蕉叶片中没有检测到该基因的表达。应用蛋白质双向技术体系(包括香蕉叶片蛋白质提取方法的比较和优化、双向电泳条件的优化),开展了香蕉低温胁迫的比较蛋白质组学实验,对差异蛋白质进行了质谱鉴定和功能分析。分别用TCA／丙酮沉淀法、酚提取香蕉叶片总蛋白,并比较两种方法的提取效果,结果表明酚法是提取香蕉叶片总蛋白质最好的方法,提取的蛋白最完整。分析低温胁迫香蕉幼苗的叶片和正常生长香蕉幼苗的叶片蛋白质图谱,发现低温胁迫后特异表达蛋白质11个,2.5倍上调蛋白点4个,0.5倍下调蛋白13个。对28个差异蛋白质进行了质谱鉴定,2号为乙酰辅酶A羧化酶,3号和6号样品为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶／加氧酶,还有8个与已知功能蛋白具有较高的同源性,7个属于未知功能的推测蛋白,5个属于未知功能的蛋白,另外5个样品在数据库中未检索到同源性和匹配率较高的蛋白质。这个结果表明,通过对构建的抑制性cDNA消减文库和筛选差异蛋白的全面分析,可能有相当多的未知功能基因参与了香蕉抗寒的过程。对其功能的深入了解将为全面解析香蕉寒害的分子机制、阐明寒害过程中的信号转导过程打下基础。