论文部分内容阅读
自噬是细胞降解自身物质的过程,有助于细胞维持内环境稳定和平衡。现已有大量实验数据证明自噬是在多种自噬相关基因(autophagy-related gene,Atg)严格的调控作用下,细胞自卫的一种方式。在自噬的起始阶段Atg1能够结合多种自噬相关蛋白,形成Atg1复合物,该复合物接收来自细胞营养状态的信号,将下游Atg蛋白募集到自噬前体(pre-autophagosomal structure,PAS)的组装位点,并控制自噬体(autophagosome)形成。已知在酿酒酵母中Atg1复合物主要由Atg1-Atg13-Atg17-Atg29-Atg31蛋白组成;哺乳动物Atg1复合物的同源物是ULK1复合物,主要由ULK1-Atg13-FIP200-Atg101蛋白构成。在不同物种中Atg1复合物的组分不同可能导致其控制自噬启动的调节机制不同。目前对鳞翅目昆虫Atg1复合物中互作蛋白的研究相对较少,且Atg1复合物中各亚基蛋白对细胞自噬的调控机制还不清楚。本实验主要对斜纹夜蛾(Spodoptera litura(Fabricius))Atg1复合物中相互作用蛋白的研究以及部分自噬相关蛋白功能的初步探索。实验以斜纹夜蛾为材料克隆得到Atg13、FIP200和Atg9的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列;接着构建昆虫细胞表达载体Atg13-F1ag、Atg13-GFP、Atg101-GFP、FIP200-GFP,在S1-HP细胞中将Atg13分别与Atg1、Atg101、FIP200蛋白共表达,观察两种蛋白之间是否存在共定位;然后构建昆虫细胞双分子荧光表达载体YFPN-Atg13、Atg9-YFPC、FIP200-YFPC,通过双分子荧光互补技术探究Atg13与Atg1、Atg101、FIP200蛋白是否存在相互作用,以及Atg1与Atg9和FIP200蛋白是否存在互作;最后通过干扰实验检测Atg13、AMPK、Atg9 RNAi对细胞自噬的影响。本研究得到Atg13、FIP200和Atg9的ORF全长分别为1281 bp、3915 bp和2289 bp,预测编码的氨基酸分别为426个、1304个和762个,等电点分别为5.46、5.20和7.63。免疫荧光的实验结果显示Atg13与Atg1、Atg101、FIP200蛋白存在部分共定位,共定位分布于S1-HP细胞的细胞质中。双分子荧光互补实验显示Atg13与Atg1有较强的相互作用信号,在细胞质中呈小颗粒点状均匀分布;Atg13与Atg101、FIP200蛋白互作的信号相对较弱,在细胞质中呈大颗粒点状不均匀分布;Atg1与Atg9和FIP200蛋白没有发现明显的互作信号。干扰实验显示Atg13和AMPK干扰后阻止了毒素诱导的自噬发生,且细胞对毒素的敏感性降低,这表明Atg13和AMPK干扰后降低了细胞自噬水平,而Atg9干扰后对细胞自噬没有显著性影响。这些实验结果为揭示SlAtg1复合物在细胞自噬中的作用提供了重要依据。