前言 真空冷冻干燥保存法(VFDP)保存角膜技术是在深低温冷冻保存法和脱水干燥保存法基础上建立起来的。它是将离体的角膜组织经过深低温冷冻使组织内的水分凝结成固态，然后在真空条件下使固态的水升华。评价保存效果的关键是对角膜内皮细胞活性的检测。角膜内皮细胞活性可反映在内皮细胞的酶活性上。利用光镜、电镜酶组织化学方法可测定兔角膜内皮细胞酶活性。本实验研究旨在通过光镜、电镜酶组织化学方法对冻干保存的兔角膜内皮细胞的三磷酸腺苷酶(ATPase)及琥珀酸脱氢酶(SDH)进行检测，从而判定真空冷冻干燥保存法(冻干法)对于兔角膜内皮细胞活性的影响。 材料和方法 1 实验设备及试剂 真空冷冻干燥机(东北大学制造) 二甲基亚砜、柠檬酸铅、四唑氮蓝、琥珀酸钠、左旋咪唑等：美国SIGMA化学试剂有限公司。 20％人白蛋白：上海莱士血制品有限公司。 简易降温仪(自制) 2 动物来源及分组 成年大耳白兔，2.5～3.0kg，18只 根据随机原则及配对原则将36只兔眼分为3组，每组12只，分别为冻干实验组、冷冻对照组和新鲜对照组。 3基本操作 3．l配制冷冻保护液： 二甲基亚矾（DMSO）浓度（V／V）为5％上％，与20％人白蛋白配制成2．sml的保护液。 3．2制备兔角膜片： 制作出一个带2—3nun巩膜环的角膜片。 3．3配制复水液： 1640加 20％兔血清 3．4深低温冷冻保存兔角膜： 4t条件下将角膜片依次放人1号液在号液中各平衡20win；梯度降温；液氮内保存； 3，5真空冷冻干燥保存兔角膜： 冷冻前处理及梯度降温同深低温冷冻法。冻干机内冻干，充氮封盖。室温或冰箱保存。 3．6冷冻角膜的复温 3．7冻干角膜的复水 4光镜酶组织化学方法 4．INa”－K”三磷酸腺耷酶（Na”－K”－ATPase）显示法 新鲜角膜片、冷冻复温角膜片、冻于复水角膜片标记，固定，漂洗，置于AWe孵育液内孵育60ndn，反应后的处理，明胶封片，光镜观察，为细胞膜上的棕色颗粒 4．二貌来酸脱氢酶门DH）显示法 新鲜角膜片、冷冻复温角膜片、冻于复水角膜片置于SDH孵育液内孵育，后固定，漂洗，甘油明胶片片，光镜观察。为胞浆内的蓝色颗粒。 5电镜酶组织化学方法 孵育的组织后固定，漂洗，梯度脱水，EponslZ包埋，制作超薄切片，醋酸铀染色透射电镜下观察，拍片。 ·二· 6统计学分析： 应用Metajnrph图象采集系统，测定角膜酶染色切片的积分光密度值，应用 SPSSll对软件对数据进行统计学处理。 实验结果 亚光镜酶组化的观察结果 ATPase和SDH新鲜角膜、冷冻角膜、冻干角膜均呈阳性反应。实验组与对照组相比，颜色较浅，平均积分光密度值较低，差异具有统计学意义河d．01） 2电镜酶组化的观察结果 ATPase新鲜角膜、冻干角膜上可见细胞膜连续完整，有黑色的ATh酶颗粒均匀沉着于细胞膜上。冷冻角膜见细胞膜不连续，黑色的酶颗粒存在于细胞膜上及细胞内。 SDH三组标本均为内皮细胞层脱落，末能观察到结果。 讨 论 角膜的冻干保存法是在深低温冷冻保存法及干燥保存法的基础上建立起来的。冻于的角膜片可以在冰箱及室温下保存，运送方便，成本较低，值得研究。冻干法保存角膜的过程包括深低温冷冻阶段和干燥阶段。首先，对离体的免角膜片进行深低温冷冻。将冷冻后的角膜片迅速移至真空冷冻干燥机的干燥室内。利用控制其真空度的方法使角膜组织内固态的水升华。使用时在适当的条件下复水，使干燥的组织尽可能恢复其原有的生理状态。 角膜内皮细胞存在着多种酶，其中活性较高的为统来酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶，ATP酶，酸性磷酸酶等。这些酶均参与细胞内的组织代谢过程。应用酶组织化学法测定内皮细胞的酶活性，可 ·3·以间接地反映内皮细胞的活性。 本实验中三组标本ATPse和SDH酶组织化学染色光镜观察鲫呈阳性反应，细胞形状清晰可见，为规则的六角形，说明三组标本的内皮细胞ATPase和SDH酶均有活性。活性反应的强弱程度是应用图像分析系统进行积分光密度值的测定用S伯统计软件来进行分析。结果表明冻干保存的兔角膜内皮细胞与新鲜及冷冻保存的角膜内皮细胞一样均具有一定的活性，但也存在一定的差异。冻干组的平均积分光密度值比对照组（冷冻组和新鲜组）的平均积分光密度值低，差异具有统计学意义。孙为荣等曾报道过关于冷冻保存角膜内皮细胞的酶组织化学观察，与本实验结果类似。 电镜酶组织化学方法观察到ATPase酶颗粒在细胞膜上呈线性连续分布，余改变与石珍荣所报道的相一致。SDH电镜未观察到结果。考虑是由于SDH染色时先孵育，后固定，引起角膜水肿，单层的内皮细胞容易脱落所致。 冻干保存兔角膜的技术在国内外尚无先例，?