【摘 要】
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近年来,CAR-T细胞治疗成为肿瘤治疗领域的热点,在临床中,针对CD19高表达的血液系统肿瘤展现出良好的治疗效果。然而CAR-T疗法应用于实体瘤治疗时却面临诸多问题。例如,肿瘤微环境中免疫抑制性微环境阻碍了CAR-T细胞对实体瘤的杀伤;实体瘤块的物理屏障;缺乏肿瘤特异性抗原等。因此亟待一种额外的治疗手段以增强CAR-T的治疗实体瘤的疗效。在本课题组前期动物试验中,观察到重组Ⅱ型单纯疱疹病毒（Onc
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近年来,CAR-T细胞治疗成为肿瘤治疗领域的热点,在临床中,针对CD19高表达的血液系统肿瘤展现出良好的治疗效果。然而CAR-T疗法应用于实体瘤治疗时却面临诸多问题。例如,肿瘤微环境中免疫抑制性微环境阻碍了CAR-T细胞对实体瘤的杀伤;实体瘤块的物理屏障;缺乏肿瘤特异性抗原等。因此亟待一种额外的治疗手段以增强CAR-T的治疗实体瘤的疗效。在本课题组前期动物试验中,观察到重组Ⅱ型单纯疱疹病毒（Oncolytic herpes simplex virus type 2,oHSV2）能显著抑制B16R（黑色素瘤）生长。此外,经oHSV2治疗小鼠PBMC中CD4+和CD8+T细胞比例高于对照组,髓系来源的抑制性细胞（MDSC）比例低于对照组,提示oHSV2进行肿瘤治疗时可能活化免疫系统中的T细胞,发挥治疗作用。因此,我们提出假设:oHSV2与CAR-T细胞联用对实体瘤能有较好的治疗效果。为验证这一假设,我们制备了鼠源CAR-T（mCAR-T）细胞,并从体外肿瘤细胞模型和免疫健全的小鼠荷瘤模型两个方面探索oHSV2联合mCAR-T对肿瘤的杀伤作用。本课题围绕以下三部分内容展开研究:（1）制备感染小鼠T淋巴细胞的逆转录病毒。利用分子克隆技术构建靶向CD19的p MSCV-m1928z-IRES-GFP II逆转录病毒载体,经过菌落PCR和测序验证,我们成功构建了p MSCV-m1928z-IRES-GFP II逆转录病毒载体。经过Lipofactamine 3000转染入HEK-293T细胞中生产出逆转录病毒上清液,经过超速离心法获得浓缩后的逆转录病毒,并通过感染NIH-3T3细胞检测滴度。浓缩后的逆转录病毒滴度结果为2×108 TU/m L。（2）制备mCAR-T细胞并验证其活性。使用T淋巴细胞阴选试剂盒从C57BL/6小鼠体内分离培养T淋巴细胞,并绘制出T淋巴细胞的增殖曲线,从而获得逆转录病毒感染T淋巴细胞的最佳时间,使用高速离心法使逆转录病毒感染小鼠T淋巴细胞,共孵育后获得mCAR-T细胞;使用Piggy Bac系统构建稳定表达CD19的B16R-CD19的单克隆稳转细胞系,使用流式细胞仪检测该细胞系的纯度与CD19的阳性率,同时本实验室已成功构建CT26-CD19细胞系,两者作为验证mCAR-T细胞活性的靶细胞。结果显示B16R-CD19细胞系CD19阳性率为99.8%。因此可以将mCAR-T细胞与表达CD19抗原的肿瘤细胞以不同效靶比共孵育,使用RTCA活细胞实时监测仪器监测mCAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果。结果显示在效靶比为5:1和10:1时,与对照组相比,mCAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果较好。（3）oHSV2与mCAR-T联用进行体外和体内治疗。使用Vero细胞生产出oHSV2并检测其滴度,以不同MOI感染肿瘤细胞,使用RTCA活细胞实时监测仪对oHSV2杀伤肿瘤细胞的过程进行监测,结果显示,随着oHSV2的MOI增大,病毒对肿瘤细胞的杀伤能力逐渐增强。利用oHSV2与mCAR-T联合对CT26-CD19细胞杀伤,结果显示,与对照组相比,当oHSV2的MOI=0.25,效靶比为5:1和10:1时,oHSV2与mCAR-T细胞联用对靶细胞的杀伤效果较好。继而我们将B16R-CD19细胞皮下植瘤并建立了免疫健全的小鼠C57BL/6 B16R-CD19荷瘤模型,对该模型单独和联合给药治疗。结果显示,oHSV2与mCAR-T细胞联用对B16R-CD19实体瘤有较好的治疗效果。这些研究初步表明oHSV2与mCAR-T细胞联用对实体肿瘤治疗具有潜在的应用价值。
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