研究目的 探讨生物人工肾小管的体外构建方法，对急性肾衰竭合并多脏器功能障碍综合征／多器官衰竭（ARF并MODS／MOF）的治疗作用以及通过基因工程的方法使其功能进一步优化（肾小管上皮细胞永生化），旨在体外能生物性模拟。肾小管功能，完善目前肾替代治疗只能替代肾小球滤过功能之不足，提高肾替代治疗的存活率。 方法 猪肾近曲小管上皮细胞株（LLC-PK1）体外培养后植入血液滤过器（FH66）中空纤维内腔继续培养。期间以MTS方法测定滤器内细胞活性。二周后在体外模拟液体滤过，测定钠离子（Na⁺）、钾离子（K⁺）、钙离子(Ca²⁺)、肌酐（Cr）、葡萄糖（Glu）及氨基酸重吸收功能的变化。并观察哇巴因、根皮苷对Na⁺、Glu、氨基酸重吸收的影响。 应用盲肠结扎和穿孔（CLP）合并双侧输尿管结扎术（UL）制作MODS并ARF猪模型。随机分为RAD治疗组（A组）、假RAD治疗组（B组）、CVVH治疗组（C组）和未治疗组（D组）。观察生命体征、肝肾功能、细胞因子IL-10、TNF-α和生存时间。 在上述实验基础上，进一步构建永生化人肾近曲正义南京医科人学博}学位论文小管上皮细胞株以优化RAD功能。人胚肾细胞株（293细胞）培养后，用RT一PCR方法扩增出ad5EIA基因。Kpnl和Ehol双酶切后与pshuttle CMV载体连接并测序。联合应用Lipofectamine转染原代培养的人肾近曲小管上皮细胞，筛选出阳性克隆，RT一PCR鉴定目的基因的表达，免疫荧光测定蛋白表达。并用MTT及流式细胞仪测定其生长特性。通过AKP、LDH、NAG及钠钾ATP酶的检测明确转化后细胞的功能并与H KZ细胞株作比较。 结果 采用上述方法构建的RAD体外实验中肌醉重吸收率较对照组明显降低（P<0.01）;初始RAD组与对照组的Na+、葡萄糖、氨基酸的重吸收率无明显差异（P>0.05）。液体中加入哇巴因及根皮普后，Na+、葡萄糖、氨基酸的重吸收率明显降低且与对照组相比有明显差异（P<0.01）。祛除药物抑制因素后，重吸收率又能恢复，与阴性对照组差异不明显（P>0.05）。 利用RAD治疗MODs/ARF动物的实验中，四组动物治疗前平均动脉压（MAP）无显著性差异。RAD组（A组）治疗后血压逐渐回升，MAP显著高于同时间点的假RAD组（B组）、常规CVVH组（C组）和非治疗组（D组）（P<0.01）;四组动物治疗前血肌醉（SCr）无显著差异;治疗24hA、C组SCr水平明显低于B、D组（P<0.05），A、C组之间则无显著性差异。A组治疗后IL一10的峰值显著高于其余三组 （P<0.01）。A组治疗开始24小时后血TNF一a水平较治疗前显著降低（P<0.05），亦低于同时间点C组血TNF一a水平（P<0.05）;而B、D组治疗过程中各时间点血浆TNF一a水平未见明显变化（P> .05）。A组的平均生存时间为110.25士18.69h，明显长于其余三组。IF文南京医科人学博}丫一位论文 永生化细胞构建实验中，RT一PCR方法成功从293细胞扩增出ad5E IA基因。经双酶切与载体连接后，测序结果证明重组质粒构建成功。随后应用Lipofectamine转染成功筛选出阳性克隆，能持续生长并稳定传代30代以上。RT一PCR证实ad5EIA基因在转化后细胞的表达，免疫荧光证明了ad5EIA蛋白的表达。MTT测定结果显示ad5EIA表达的人近曲小管上皮细胞与对照组细胞相比，生长速率明显增快（P<0.05）。流式细胞仪结果显示转化后细胞GO/Gl期比例较对照组明显减少（P<0.05）。转化后细胞的AKP、NAG、钠钾ATP酶活性均高于HKZ细胞株 （P<0 .05） 结论 采用LLC一PKI细胞株作为细胞来源构建的RAD具有理想的体外选择性重吸收功能，其功能在5小时内能稳定维持，证明本实验中所采用的更为简便的方法构建RAD具有可行性。 用RAD治疗改善了MODS/MOF的生命指标（如MAP）和肾功能（SC:），并使血中IL一10升高、TNF一a下降，进而延长了动物生存时间。 利用ad5EIA基因转化原代培养人肾近曲小管上皮细胞具有可行性，转化后的细胞具有永生化特征，其部分功能优于HKZ细胞株，为今后进一步的RAD优化研究打下基础。