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聚酮化合物种类繁多,通常具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性,因而引起人们的广泛关注。聚酮化合物的碳链骨架由聚酮合酶催化。不同类型聚酮化合物生物合成途径的揭示,将为未来发现乃至创造新型聚酮化合物的研究指明方向。本研究以两个聚酮合酶基因簇为研究对象,利用遗传学、分子生物学、生物化学的研究方法,对基因簇的功能及调控进行了探索。1链霉菌SH-62基因组中聚酮合酶基因簇cluster 9的研究来自链霉菌SH-62的聚酮合酶基因簇cluster 9属于I型PKS,与数据库中已知的天然产物合成基因簇同源性较低,可能是一个新的天然产物生物合成基因簇。包含有聚酮合酶基因簇cluster 9的BAC质粒在Streptomyces albus中异源表达产生3个疑似的代谢产物。为了检测这3个化合物与cluster 9的相关性,采用两种基因组编辑方法,包括λ-Red介导的PCR-targeting系统和CRISPR/Cas9-CodA(sm)系统,对cluster 9中的核心pks基因进行了敲除。发现核心基因的敲除没有影响3个化合物的合成,说明它们并不是cluster 9的异源表达产物。2 Aureothin生物合成基因簇中调控因子AurD的研究Aureothin是具有良好生物活性的硝基芳香类抗生素,在其生物合成基因簇中只发现了一个潜在的转录调控因子aurD。敲除aurD基因会阻断aureothin的合成过程,而aurD基因的回补实验一直无法成功。考虑到aurD基因的过量表达可能会影响细胞的生长,因此本研究采用了基因原位回补的方法,将安装有组成型强启动子PermE*的aurD基因重新插入到原基因的敲除位点,成功获得了基因回补突变菌株。回补菌株的发酵产物分析证实aurD基因的回补能够恢复aureothin的产生,并且因为组成型强启动子增强了aurD基因的表达使得aureothin产量显著提升,进一步地证实了aurD对aureothin生物合成的正调控效应。AurD具有一个OmpR类DNA结合结构域和一个细菌转录激活结构域,属于SARP家族转录调控蛋白。为了研究AurD蛋白的调控机制,分别在大肠杆菌和链霉菌中超量表达AurD蛋白,在链霉菌中,AurD蛋白的表达量很低;在大肠杆菌中,AurD蛋白主要以包涵体形式存在。未来需要在表达系统和条件上进行进一步的优化。