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目的:研究白介素-1(interleukin-1β,IL-1β)在角膜移植免疫排斥反应中的作用,进一步探讨IL-1β参与角膜移植免疫排斥反应的机制。方法:(1)构建小鼠穿透性角膜移植模型,并随机分为正常对照组、同系移植组、异系移植组、异系移植并IL-1β中和性抗体处理组。在此基础上,通过裂隙灯观察IL-lβ中和性抗体对角膜移植免疫排斥反应的影响;并利用Real-time PCR和Western blot检测各组小鼠角膜植片中IL-lβ及其受体IL-1R1等的表达水平;免疫荧光分析IL-lβ受体IL-1R1的表达水平及其分布情况。(2)分别利用野生型小鼠和NLRP3缺陷小鼠构建穿透性角膜移植模型,并随机分为正常对照组、同系移植组和异系移植组。在此基础上,通过临床观察研究干预NLRP3炎症小体抑制IL-lβ成熟对角膜抑制免疫排斥反应的影响;并进一步利用Western Blot和免疫荧光技术分析角膜移植免疫排斥过程中NLRP3和IL-1β表达水平的变化;使用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测角膜植片中白介素-17(Interleukin-17,IL-17)和干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)的含量。此外,我们还利用NLRP3炎症小体抑制剂Glubide验证阻断NLRP3炎症小体活化对角膜移植免疫排斥反应的影响。(3)体外无菌分离小鼠骨髓,通过巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage-colony stimulating factor,M-SCF)诱导骨髓源巨 噬细胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs)在此基础上,行脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)刺激,并通过Western Blot分析不同组别内巨噬细胞中IL-1β表达水平的变化,ELISA检测各组细胞培养上清中IL-1β的含量。(4)无菌分离脾细胞,并将其分成空白对照组、IL-6+TGFβl处理组以及IL-6+TGFβl+IL-1β 处理组;同时利用 Anti-CD3(15μg/ml)和 anti-CD28(5μg/ml)刺激96h,通过流式细胞术检测不同组别细胞中Th17细胞的相对含量,并采用FLLSA检测不同组别细胞培养上清中IL-17的含量。(5)构建小鼠穿透性角膜移植模型,随机分为异系移植组、异系移植并IL-17抗体治疗组。在此基础上,通过临床观察评估IL-17中和性抗体对角膜移植免疫排斥反应的影响;通过苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)评估不同组别角膜植片的病理改变。结果:(1)与同系移植组相比较,异系移植组小鼠角膜植片中的IL-1β mRNA水平明显著增加;Western blot结果显示:活化形式的IL-1β在异系移植组中的水平明显高于同系移植组。同时,IL-1β受体IL-1R1的表达水平在角膜免疫排斥过程中也显著增强,且广泛表达于发生免疫排斥小鼠角膜植片的上皮层、基质层和内皮层。IL-1β中和实验表明IL-1β中和性抗体可显著延长角膜植片的存活时间。以上结果提示IL-1β可促进角膜移植免疫排斥反应的发生。(2)Western blot结果表明,发生免疫排斥反应的小鼠角膜植片中NLRP3的表达水平显著增加,且主要表达于角膜植片的上皮层、基质层以及内皮层。与对照组相比,利用Glubide抑制NLRP3炎症小体的活性可明显延长角膜植片的存活时间,并有效减轻角膜移植排斥反应。与野生型小鼠模型比较,NLRP3缺陷小鼠角膜植片存活时间明显延长;但向NLRP3缺陷小鼠回输IL-1β则可明显促进角膜移植免疫排斥反应的发生。通过ELISA检测发现,NLRP3缺陷小鼠角膜植片中IL-17的水平显著降低,而IFN-γ的水平则没有显著变化,提示NLRP3炎症小体可能通过影响Th17细胞免疫反应参与角膜移植免疫排斥反应。(3)通过BMDM模型发现,与野生型BMDM比较,NLRP3缺陷的BMDM分泌IL-1β的能力显著下降。通过体外共培养实验发现,与野生型BMDM培养上清处理组相比较,NLRP3缺陷BMDM培养上清刺激Th17细胞分化的能力显著下降;ELISA的结果显示,NLRP3缺陷BMDM培养上清诱导产生的Th17细胞分泌IL-17的能力也明显下降。上述结果表明IL-1β可促进Th17细胞免疫反应。(4)与对照组相比,IL-17中和性抗体可明显延长角膜植片存活时间;病理分析结果显示:IL-17中和性抗体可有效抑制角膜植片炎性细胞浸润。上述结果表明Th17细胞免疫反应参与角膜移植免疫排斥的病理过程。结论:(1)角膜移植免疫排斥过程中,角膜植片中IL-1β的表达水平显著增强,中和IL-1β可延长角膜植片存活时间。(2)角膜移植免疫排斥过程中,角膜植片中的NLRP3表达水平明升高,通过干预NLRP3炎症小体抑制IL-1β的成熟可有效抑制角膜移植免疫排斥反应。(3)IL-1β通过诱导Th17细胞参与角膜移植免疫排斥反应,中和IL-17可延长角膜植片存活时间。