偏甘油酯脂肪酶是一种对酯类底物有高度选择性的脂肪酶,能水解甘油单酯和甘油二酯底物,对甘油三酯底物无水解活力。其独特的底物识别特性使其在油脂加工及脂质改性领域具有广阔的应用前景。但目前已知的偏甘油酯脂肪酶种类甚少,对其基础理论及应用研究仍有待深入。本论文以娄地青霉(Penicillium roqueforti)来源的偏甘油酯脂肪酶Pr Lip为研究对象,研究其异源表达及纯化、酶学性质、晶体学结构及在高酸价油脂脱酸中的应用,为阐明偏甘油酯脂肪酶的催化功能提供结构基础,同时为工业应用提供科学指导。具体研究内容以及结果如下:(1)偏甘油酯脂肪酶Pr Lip的制备及酶学性质研究。构建Pr Lip毕赤酵母基因工程菌,筛选获得高效表达目标蛋白的阳性克隆菌株。30℃发酵培养60 h后利用阴离子交换层析法纯化粗酶液,获得纯度大于90%的重组Pr Lip,SDS-PAGE显示其蛋白分子量大小为31 k Da。酶学性质表征结果显示:该酶的最适反应温度为45℃,最适反应p H值为7.0,40℃条件下半衰期为6 h。Pr Lip在碱性环境中更稳定,具有良好的温度耐受性及表面活性剂耐受性。通过Pr Lip催化水解及酯化反应证实其为偏甘油酯脂肪酶。(2)偏甘油酯脂肪酶Pr Lip的晶体制备及结构解析。通过凝胶过滤色谱层析进一步获得高均一性的Pr Lip蛋白,采用气相扩散法获得符合衍射条件的蛋白晶体,结晶条件为:蛋白浓度9 mg/m L,温度4℃,0.1 M醋酸钠(p H 4.0)、26%(w/v)PEG 1500。经分子置换及结构修正,解析得到分辨率为1.8?的三维结构(PDB ID:6L7N)。Pr Lip属于典型的α/β水解折叠酶,由8个互相平行的β折叠及12个α螺旋组成。结构比对结果表明:Pr Lip“盖子”区域为Gly82-Val96,为典型的两亲性α螺旋,催化三联体为Ser145-Asp199-His259,氧负离子洞为Ser83和Leu146。(3)固定化偏甘油酯脂肪酶Pr Lip催化高酸价米糠油脱酸的性能评估。通过比较8种树脂及优化固定化条件,最终在ECR8806树脂、p H 7.0(20 m M)磷酸盐缓冲液和20mg/g酶载比的条件下,获得酯化活力为879 U/g的固定化Pr Lip。将其应用于高酸价米糠油脱酸中,并进行反应参数的优化,结果表明:以乙醇作为酰基受体,在乙醇与游离脂肪酸摩尔比为2:1,反应温度35℃,酶加量为60 U/g及4 m L/g(底物油)的正己烷体系中,催化反应8小时,米糠油中的游离脂肪酸含量由39.16%降至1.02%,脱酸效率达97.4%。