JAK／STAT信号转导通路在类风湿关节炎发病中作用的实验研究前言类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以多关节受累为主要表现的慢性自身免疫性疾病，具有较高的发病率和致残率，是造成人群劳动力丧失的主要疾病之一，因其病因及发病机制尚未完全明确，目前仍缺乏满意的治疗方法。因此，进一步明确RA发病机制并寻找更安全、高效的治疗方法是目前亟待解决的难题。尽管RA的病因及发病机制尚未完全明确，但大量研究证实：RA是一种主要由细胞因子参与介导的慢性炎性疾病。RA滑膜细胞及滑膜组织中浸润的单核／巨噬细胞、淋巴细胞等通过自分泌或旁分泌的方式产生大量的细胞因子，它们相互作用，相互促进，形成一个复杂的网络，是引起炎症免疫、蛋白质水解、细胞募集和增殖的重要媒介，在RA滑膜病变中起核心作用。而这些细胞因子绝大多数为低分子量的多肽或糖蛋白，必须与靶细胞表面相应的受体结合，激活特定的信号转导通路才能发挥生物学效应。同时这些信号转导通路与许多细胞因子共享，如明确其在RA发病中的作用并选择性阻断它们将可能比现有的治疗手段更有效。因此，近年来滑膜细胞信号转导通路及滑膜细胞增殖信号对核内基因表达的调控备受关注。Janus激酶／信号转导子与转录激活子（janus kinase signal transducersand activators of transcription，JAK／STAT）是继Ras途径之后发现的又一重要的细胞因子信号转导通路，在调节细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节、炎症、肿瘤等多种病理生理过程中发挥重要的作用。既往关于JAK／STAT信号转导通路的研究大多集中在造血系统、淋巴系统疾病及肿瘤，其在RA发病中的作用研究较少。RA滑膜组织中白细胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-15（interleukin-15，IL-15）、干扰素（interferon，IFNs）、粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）的水平显著升高，在RA的发生发展过程中发挥重要作用，而上述细胞因子均通过JAK／STAT信号通路发挥作用，因此推测JAK／STAT信号通路参与了RA的发病。目前国外的一些研究已证实，在RA发病过程中JAK／STAT信号通路处于激活状态。但由于STATs分子是一组多效性的蛋白质，在不同的条件下或不同类型的细胞中，可以表现出不同的生物学功效，因而JAK／STAT信号通路在RA发病过程中有哪些成员被激活以及其在RA发病中的作用尚未明确。本研究拟在胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型上探讨JAK／STAT信号通路在RA发病过程中的激活规律、其参与RA发病的机制及阻断该通路对RA的治疗价值，从而从一个新的角度探索RA的发病机制，并为治疗RA提供新的靶点。方法1、建立胶原诱导的关节炎大鼠模型，应用免疫组化及免疫印迹法定位、定量检测在关节炎发病第2、3、4、5、6周滑膜组织磷酸化的STAT1及STAT3蛋白表达的动态变化规律及二者与关节炎指数、组织病理学评分等指标的关系。2、应用不同剂量(1、5、10mg·kg^-1·d^-1)JAK／STAT信号通路特异性阻断剂AG490，观察其对胶原诱导的关节炎大鼠体重、关节炎指数、足趾容积、组织病理学评分及p-STAT1、p-STAT3蛋白表达的影响，并以来氟米特为阳性对照，评价阻断JAK／STAT信号通路在RA治疗中的价值，从而进一步明确该通路在RA发病中的作用。3、应用RT-PCR及免疫印迹法检测在关节炎发病过程中凋亡调控因子Bcl-2、Bcl-x1、Bax的基因及蛋白质表达水平及凋亡蛋白酶-3 （Caspase-3）活性的变化，并观察应用JAK／STAT信号通路阻断剂后上述指标的变化情况，从而明确JAK／STAT信号通路对上述凋亡调控因子的调节作用。结果1、Wistar大鼠CIA发生率达75％左右。在初次免疫后14～18天大鼠开始出现关节炎表现，初次免疫后第4周关节肿胀达高峰，第5、6周部分大鼠出现关节强直，其临床过程及病理学变化与人类RA极其相似，是人类RA病理过程的缩影。2、在正常大鼠的滑膜组织未见可探测到水平的p-STAT1及p-STAT3的阳性表达，而在关节炎发病过程中，STAT1及STAT3均被激活，其中STAT3在初次免疫后2、3、4、5、6周处于持续激活状态，而STAT1的激活只局限于疾病的中晚期。3、p-STAT1及p-STAT3的蛋白表达与关节炎指数呈明显正相关，r值分别为0.798、0.873，P＜0.01，二者的高峰表达时间与关节肿胀最严重的时间相一致，均发生在初次免疫后第28d；同时p-STAT3的蛋白表达与滑膜组织病理学评分亦呈正相关，r值为0.622，P＜0.05，而p-STAT1的表达与组织病理学评分无明显相关性。4、阻断JAK／STAT信号通路可以明显减轻关节炎大鼠关节肿胀程度，大鼠体重增加，关节炎指数、足趾容积及组织病理学评分等指标与模型组比明显改善，其疗效呈剂量依赖性。其中5mg·kg^-1·d^-1组疗效与来氟米特相当，10mg·kg^-1·d^-1组在组织病理学评分改善方面优于来氟米特组。同时AG490起效明显早于来氟米特，其在应用后1周左右足趾容积等指标与模型组比即有显著性差异，而来氟米特组则至少在用药2周后才起效。5、JAK阻断剂可明显阻断下游STAT1及STAT3的活化，其阻断作用具有剂量依赖性，但大剂量即AG490 10mg·kg^-1·d^-1亦不能完全阻断CIA发病过程中STAT1及STAT3分子的激活（与对照组比P＜0.05）。6、在关节炎发病过程中存在凋亡调控因子表达异常，其中凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-xl基因及蛋白质表达均明显上调，二者mRNA表达水平分别为对照组的2.65、3.39倍，蛋白表达为对照组的5.22及4.01倍；而促凋亡因子Bax表达虽然也轻微上调，但其升高比例远远低于上述凋亡抑制因子升高比例，其基因及蛋白质表达分别为对照组的1.39、1.44倍。7、JAK／STAT信号通路对凋亡调控因子具有调节作用，阻断该通路可以下调凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-xl基因及蛋白质表达水平，上调促凋亡因子Bax的基因及蛋白质水平。模型组及不同剂量AG490组Bcl-2／Bax蛋白表达比值分别为4.69、4.08、3.28及2.35，而Bcl-x1／Bax的比值分别为3.59、2.57、1.93及1.02，同时可增加Caspase-3的活性，不同剂量AG490 Caspase-3蛋白表达分别为模型组的1.28、2.11及2.27倍。结论1、在关节炎发病过程中JAK／SIAT信号通路处于激活状态，并主要发挥致病作用，参与了慢性滑膜炎的发生发展。2、在RA发病过程中，JAK／STAT信号通路对凋亡调控因子具有调节作用，上调凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-xl的表达，导致滑膜组织增殖／凋亡失衡，从而参与RA的发病。3、阻断JAK／STAT通路可以下调凋亡抑制因子的表达，上调促凋亡因子的表达，从而减轻滑膜组织的过度增殖，改善关节炎临床症状，其疗效呈剂量依赖性。