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目的:重组激活基因(rag1 和rag2)通常只在未成熟的淋巴细胞中表达,它们的编码产物共同组成的重组酶(recombinase)启动Ig基因和TCR基因的V(DH)J重排,在Ig和TCR库多样性的形成过程中起着重要的作用。同时,重组激活基因在T、B淋巴细胞发育的各个阶段呈规律性表达,可用来监测T、B细胞在免疫系统发育过程中出现的时机和部位,是追踪淋巴组织发育的有用标记。channel catfish(学名Ictalurus punctatus),具有便于鉴别突变类型和基因筛选的特点,作为硬骨鱼类的一种,是最早进化出明显的结构性抗原受体基因DH片段的脊椎动物之一,因此channel catfish是研究早期硬骨鱼发育和免疫系统进化的良好模式生物。channel catfish rag1基因表达检测需要rag1基因的序列信息。基于rag1基因的高度保守设计简并引物,扩增channel catfish基因组DNA中序列未知的rag1基因的片段,并克隆、测序以及用多种生物信息学方法对所得channel catfish rag1基因序列及预测的Rag1蛋白氨基酸序列料进行分析,有助于研究rag1基因的早期进化模式、遗传变异特点、Rag1蛋白的活性部位和作用方式等。另外,探讨rag1基因表达在淋巴细胞来源肿瘤MRD检测中的应用价值。方法:Channel Catfish 基因组DNA提取自4~6月龄成年Channel Catfish的前肾组织。设计简并引物, PCR扩增channel catfish基因组DNA中rag1基因的片段,胶回收目的片段,TA克隆并双向测序。将所得序列资料拼接,然后利用NCBI网站中“ORF Finder”工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)做ORF分析,利用“NetGene内含子/ 外显子剪接位点识别工具”(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)做内含子分析,以及序列相似性的两两比较(BLAST-N)、预测氨基酸序列的相似性分析(BLAST-X)和多序列比较及系统进化树分析(clustal W,http://www. cbi. ac. uk/ clustalw/)等。用discovery studio gene v1.1软件分析其预测氨基酸序列的二级结构。用“SWISS-MODEL”网上工具模拟人和channel catfish Rag1蛋白的三级结构(http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)。在NCBI网站中用Bankit工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt/)提交序列到GenBank,申请序列号。 <WP=9>5. 提取35例淋巴细胞来源的肿瘤患者57份外周血标本中单个核细胞的基因组DNA 和总RNA, 用RT-PCR检测rag1基因表达,用通用引物PCR联合检测IgH 和TCRγ基因重排。提取Jurkat 细胞株的基因组DNA 和总RNA作阳性对照。结果:用简并引物扩增出三段channel catfish rag1基因的DNA片段, 其序列经BLAST分析证实。找到一2235bp的ORF,编码744个氨基酸, (G+C)%为49.3%,起始密码子是624位起的ATG, 终止密码子是第2856位起的TGA。发现一293bp的内含子(第 228~520位碱基),与 Zebrafish 和 Rainbow Trout rag1基因内含子的相似率分别是49.1%和44.3%。BLAST-N及BLAST-X结果显示,所得channel catfish rag1基因序列与其它物种rag1基因的相似性多大于70%, 而推导的氨基酸序列核心区域的相似性部分甚至大于80%。channel catfish的rag1基因(去除内含子后的序列)与zebrafish、rainbow trout、bull shark的rag1基因cDNA全序列碱基一致的位点占43.9%(1285/2925)。自第1352~2925位碱基(去除内含子后的Channel catfish rag1序列)为53.1%(836/1574), 而自第1~1351位碱基为33.2%(449/1351),有非常显著的差异(p<0.01)。6. channel catfish、zebrafish与亲缘关系较远的爪蛙、鸡、鼠、兔、人的rag1基因cDNA全序列和Rag1蛋白氨基酸序列的比对结果显示预测的channel catfish Rag1蛋白氨基酸序列中最保守的区域是第401~500位氨基酸,氨基酸一致位点达80%,而这一区域碱基一致位点只占43%,两者有非常显著的差异(p<0.001)。7. 以上物种Rag1蛋白的二级结构显示在这一区域均为βαβ超二级结构,并在同一位置上有一相同的较大的片层结构。8. rag1表达检测淋巴细胞来源肿瘤MRD的阳性率显著高于IgH或TCRγ基因重排单独检测(p<0.05);rag1表达检测和IgH 、TCRγ基因重排联合检测MRD的阳性率分别是73.7%(42/57)和68.4%(39/57),检测限分别为2 x 10-4和1 x 10-3, 无显著性差异,检测结果的一致率为80.7% (46/57);7份标本rag1表达检测阳性而IgH、TCRγ基因重排联合检测阴性,4份标本IgH、TCRγ基因重排联合检测阳性而rag1表达检测阴性。结论:1. 首次用简并引物成功扩增出三段序列未知的channel catfish rag1基因的DNA片段。拼接后的序列在GenBank 中的登记号是:AY423858(去除内含子序列),AY423859(包含内含子序列)。2. 对所获得的channel catfish rag1基因DNA序列作了较全面地分析,证实它只有<WP=10>一个内含子,与zebrafish和rainbow trout rag1基因内含子的位置及序列相似;有一个2235bp的ORF;同源性好,高度保守;碱基变异位点相对集中在氨基末端一侧;另外,系统进化树分析揭示出13种硬骨鱼在进化上出现时间的相对早晚以及亲缘关系的亲疏。以上结果有助于研究rag1基因的遗传学变异和早期进化模式。3. 由channel catfish rag1cDNA序列推导的Rag1蛋白氨基酸序列中第401~500位氨基酸区域最保守,在此区域内的碱基突变多是同义突变。人、兔?