背景目前心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）仍然是威胁全球人类健康的重大公共卫生问题,而动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是导致CVD的主要病因。越来越多的证据表明,AS的发生发展与细胞衰老密切相关,且细胞衰老参与AS的不同阶段。其中,内皮细胞（endothelial cells,ECs）衰老导致的内皮功能障碍发生在AS的初始阶段,同时它引发的血管稳态失衡,使血管收缩、白细胞黏附、血小板激活等,加速AS的进程。因此,阐明ECs衰老的机制,对于衰老相关AS及ASCVD的防治具有重要意义。细胞衰老分为复制性衰老和压力诱导的过早衰老（也称应激性衰老）,两者具有相似的后果。血管紧张素II（angiotensin II,AngⅡ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要效应物,与血管ECs的应激性衰老有关。研究表明,AngⅡ在细胞外基质成分的改变、炎症反应的激活和氧化应激的产生中发挥关键作用,而它的信号级联反应随着年龄的增长而增加,抑制AngⅡ活性可以降低衰老相关ASCVD的发病率和死亡率。信号传导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）是一种信号传导及转录激活因子,通常定位于细胞质中,激活后转移至细胞核中与DNA结合发挥生物学效应。研究表明,STAT3是细胞衰老和生长停滞的关键调节因子。STAT3不仅可以激活P53/P21信号通路,而且也是氧化应激信号通路的主要组成部分;此外,抑制STAT3的激活可导致与衰老和衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）相关基因的表达下降,同时它的激活剂白细胞介素-6也是诱导细胞周期停滞和SASP的关键因子。因此,STAT3信号通路在细胞衰老中发挥着重要的作用。但目前STAT3与ECs衰老的机制仍不清楚。研究表明,STAT3不仅可以被上游生长因子和细胞因子受体激活,而且非编码RNAs（non-coding RNAs,nc RNAs）也可以直接或间接调节STAT3的活性。微小RNAs（micro RNAs,miRNAs）是一类约18-25个核苷酸组成的微小nc RNAs,主要通过互补碱基配对与靶基因m RNAs的3’-非翻译区相互作用,引起靶基因m RNAs的降解和/或抑制m RNAs转化为蛋白质。越来越多的研究表明,miRNAs参与血管细胞衰老的调控,如在人脐静脉ECs复制性衰老中发现miR-21、miR-216、miR-217、miR-181b、miR-31b及miR-34a表达升高,而miR-17-92簇的成员表达下降。此外,血清miR-106b在衰老过程中也逐渐降低。且miR-106b-5p在JQ1诱导胃癌细胞（MKN28）应激性衰老中表达下降,过表达miR-106b-5p后可抑制P21的表达,阻断MKN28发生应激性衰老,提示miR-106b-5p与细胞应激性衰老有关。通过检索数据库发现miR-106b-5p与STAT3存在结合位点,但miR-106b-5p是否靶向STAT3参与ECs衰老的调控尚不清楚。研究表明circRNAs可以通过吸附相应miRNA,参与miRNA靶基因的调控,同时circRNAs具有稳定性强、物种之间保守性好及表达丰度较高的特点,可以避免miRNAs稳定性低及保守性差的弊端,并提高向临床疾病诊治靶标的转化价值。环状RNA（circular RNAs,circRNAs）是另一类特殊的nc RNAs,不仅可以通过中和内源性miRNAs,还可以与蛋白质结合,调节亲本基因表达或翻译成功能性蛋白质等多层面调控基因表达。已有研究表明,circRNAs参与细胞衰老的调控。其中,circ＿AFF1是由位于人类常染色体4q21.3位点的基因转录而来。有研究表明,它在老年人外周血中的表达明显高于青年人;且在三种不同类型细胞的复制性衰老中也升高,提示circ＿AFF1可能与细胞衰老有关。同时circRNAs通过吸附miRNAs参与细胞衰老的调控机制已被研究证实。如circ PVT1在WI-38复制性衰老中的表达下降,沉默circ PVT1可以明显降低let-7靶m RNA编码的增殖蛋白表达水平,导致细胞周期阻滞,诱发细胞衰老;此外,circ PVT1还可以靶向miR-199a-5p,减弱其对SIRT1表达的抑制作用,从而延缓细胞衰老。通过检索数据库发现circ＿AFF1与miR-106b-5p存在结合位点。同时研究显示circ＿AFF1可以通过吸附miR-516b减弱其对SAV1的抑制作用,提高Yes相关蛋白的磷酸化水平,从而抑制血管ECs的增殖和迁移。因此,我们猜测circ＿AFF1可能通过吸附miR-106b-5p调控STAT3的表达进而影响ECs衰老。目的本实验以人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery ECs,HCAECs）为研究对象,研究circ＿AFF1对AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老的影响,阐明circ＿AFF1通过吸附miR-106b-5p影响STAT3的表达进而参与HCAECs衰老的调控机制,为寻找干预HCAECs衰老的靶点提供相应的理论依据,为衰老相关ASCVD的早期预防与治疗提供新的线索和思路。方法1.利用AngⅡ刺激HCAECs,构建HCAECs应激性衰老模型。首先,利用不同浓度AngⅡ（0 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L、10-5 mol/L、10-4 mol/L）刺激HCAECs 48h,应用DCFH-DA探针测定细胞内的活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,蛋白质印迹（western blot,WB）检测衰老相关蛋白（P53、P21、P16、β-半乳糖苷酶）的表达,衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）染色检测SA-β-gal阳性细胞,选择AngⅡ诱导HCAECs衰老的最佳浓度。其次,利用最佳浓度AngⅡ刺激HCAECs不同时间（0 h、12h、24 h、48 h、72h）,分析刺激不同时间下细胞内的ROS水平,衰老相关蛋白的表达及SA-β-gal染色阳性细胞,选择AngⅡ诱导HCAECs衰老的最佳时间;进一步通过流式细胞仪检测细胞周期分布、一氧化氮检测试剂盒检测细胞培养液上清一氧化氮（nitric oxide,NO）浓度,酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒检测细胞内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,e NOS）含量,总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性检测试剂盒检测细胞内SOD活性,检测AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老过程中细胞周期、NO、e NOS及SOD的变化。2.探索STAT3参与HCAECs应激性衰老的调控机制。首先,通过实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR）和WB检测STAT3在AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老中的表达水平,明确STAT3与HCAECs应激性衰老有关。其次,分别转染si-STAT3及pc DNA3.1-STAT3,通过q RT-PCR和WB检测沉默及过表达STAT3的转染效率。然后,通过分析各组（Control、AngⅡ、si-NC、si-NC+AngⅡ、si-STAT3、si-STAT3+AngⅡ、pc DNA3.1、pc DNA3.1+AngⅡ、pc DNA3.1-STAT3、pc DNA3.1-STAT3+AngⅡ）中衰老相关蛋白的表达、SA-β-gal染色阳性细胞、细胞周期分布、细胞培养液上清NO浓度、细胞内e NOS的含量及SOD活性,明确STAT3对AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老的影响。3.探索miR-106b-5p是否靶向STAT3参与HCAECs应激性衰老的调控机制。首先,通过q RT-PCR检测miR-106b-5p在AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老中的表达水平,明确miR-106b-5p是否与HCAECs应激性衰老有关;分析各组（Control、AngⅡ、NC、NC+AngⅡ、miR-106b-5p mimics、miR-106b-5p mimics+AngⅡ、in-NC、in-NC+AngⅡ、miR-106b-5p inhibitor、miR-106b-5p inhibitor+AngⅡ）中衰老相关蛋白的表达、SA-β-gal染色阳性细胞、细胞周期分布、细胞培养液上清NO浓度、细胞内e NOS的含量及SOD活性,明确miR-106b-5p对AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老的影响。其次,利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-106b-5p与STAT3的结合关系。然后,通过q RT-PCR及WB检测STAT3m RNA和蛋白在转染miR-106b-5p mimics和miR-106b-5p inhibitor后HCAECs中的表达水平,分析miR-106b-5p对STAT3的调控作用。最后,通过miR-106b-5p与STAT3共转染,进行回复实验,分析各组（Control、AngⅡ、NC+AngⅡ、miR-106b-5p mimics+AngⅡ、NC+pc DNA 3.1-STAT3+AngⅡ、miR-106b-5p mimics+pc DNA 3.1-STAT3+AngⅡ）中衰老相关蛋白的表达、SA-β-gal染色阳性细胞、细胞周期分布、细胞培养液上清NO浓度、细胞内e NOS的含量及SOD活性,进一步验证miR-106b-5p通过影响STAT3的表达参与HCAECs衰老的调控。4.探索circ＿AFF1是否通过miR-106b-5p/STAT3参与HCAECs应激性衰老的调控机制。首先,明确circ＿AFF1是否与HCAECs应激性衰老有关,通过q RT-PCR检测circ＿AFF1在AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老中的表达水平;同时利用核糖核酸酶R（Ribonuclease R,RNase R）消化和放线菌素D抑制基因转录处理后,通过q RT-PCR检测两者对circ＿AFF1及线性AFF1表达的影响,鉴定circ＿AFF1为真实的circRNA。其次,分别转染si-circ＿AFF1和p Lenti-CMV-circ＿AFF1,通过q RT-PCR检测沉默及过表达circ＿AFF的转染效率。分析各组（Control、AngⅡ、circ-NC、circ-NC+AngⅡ、si-circ＿AFF1、si-circ＿AFF1+AngⅡ、p Lenti-CMV、p Lenti-CMV+AngⅡ、p Lenti-CMV-circ＿AFF1、p Lenti-CMV-circ＿AFF1+AngⅡ）中衰老相关蛋白的表达、SA-β-gal染色阳性细胞、细胞周期分布、细胞培养液上清NO浓度、细胞内e NOS的含量及SOD活性,明确circ＿AFF1对AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老的影响。随后,通过RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）和双荧光素酶报告基因实验检测circ＿AFF1与miR-106b-5p的结合关系;利用FISH实验观察circ＿AFF1与miR-106b-5p在HCAECs中的共定位情况;同时采用RT-PCR检测miR-106b-5p、STAT3在转染si-circ＿AFF1和p Lenti-CMV-circ＿AFF1后HCAECs中的表达情况,明确circ＿AFF1对miR-106b-5p、STAT3的调控作用。最后,通过miR-106b-5p与circ＿AFF1共转染,进行回复实验,分析各组（Control、AngⅡ、circ-NC+AngⅡ、si-circ＿AFF1+AngⅡ、circ-NC+miR-106b-5p inhibitor+AngⅡ、si-circ＿AFF1+miR-106b-5p inhibitor+AngⅡ）中衰老相关蛋白的表达、SA-β-gal染色阳性细胞、细胞周期分布、细胞培养液上清NO浓度、细胞内e NOS的含量及SOD活性,并通过WB检测各组STAT3蛋白的表达水平,进一步验证circ＿AFF1靶向miR-106b-5p/STAT3参与HCAECs应激性衰老的调控机制。结果1.利用不同浓度的AngⅡ刺激HCAECs 48h后,细胞内ROS水平、衰老相关蛋白（P53、P21、P16、β-gal）的表达、SA-β-gal阳性细胞率随AngⅡ刺激浓度的增大而升高,并在一定范围内呈浓度依赖性,其中以AngⅡ浓度为10-5mol/L时诱导HCAECs衰老相关表型变化最为显著;选择10-5mol/LAngⅡ刺激HCAECs不同时间后,细胞内ROS水平、衰老相关蛋白的表达及SA-β-gal阳性细胞率随AngⅡ刺激时间的延长而升高,以AngⅡ刺激HCAECs 48h衰老相关表型变化最为显著;此外,细胞周期中G0/G1期细胞比例随着AngⅡ刺激HCAECs时间的延长而增加,细胞培养液上清NO浓度、细胞内e NOS的含量及SOD活性随着AngⅡ刺激时间的延长而降低。2.STAT3 m RNA和蛋白在HCAECs中的表达水平随着AngⅡ刺激时间的延长而升高,提示STAT3可能与AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老有关。无论是否存在AngⅡ刺激HCAECs,与si-NC组相比,沉默STAT3组中HCAECs衰老相关蛋白（P53、P21、P16）的表达、SA-β-gal阳性细胞率及细胞周期中G0/G1期细胞比例降低,细胞培养液上清NO浓度、细胞内e NOS含量及SOD活性升高,提示沉默STAT3可抑制HCAECs衰老;而过表达STAT3组与其结果相反。3.Mi R-106b-5p的表达水平随着AngⅡ刺激HCAECs时间的延长而降低,提示miR-106b-5p可能与AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老有关。无论是否存在AngⅡ刺激HCAECs,与NC组相比,过表达miR-106b-5p组中HCAECs衰老相关蛋白的表达、SA-β-gal阳性细胞率及G0/G1期细胞比例降低,细胞培养液上清NO浓度、细胞e NOS含量及SOD活性升高,提示过表达miR-106b-5p可抑制HCAECs衰老;而沉默miR-106b-5p组与其结果相反。双荧光素酶报告基因实验显示,与NC组相比,miR-106b-5p mimics与WT-STAT3-3’UTR共转染组荧光活性显著降低,证实miR-106b-5p与STAT3-3’UTR可以直接结合;同时,与Control组相比,STAT3 m RNA和蛋白表达水平在miR-106b-5p mimics组明显降低,而在miR-106b-5p inhibitor组升高,证实miR-106b-5p对STAT3负向调控作用。在miR-106b-5p与STAT3共转染的回复实验,过表达STAT3可以部分逆转miR-106b-5p对HCAECs应激性衰老的抑制作用,提示miR-106b-5p通过STAT3发挥对HCAECs衰老的调控作用。4.Circ＿AFF1的表达水平随着AngⅡ刺激HCAECs时间的延长而升高,提示circ＿AFF1可能与AngⅡ诱导的HCAECs应激性衰老有关。Circ＿AFF1的反向引物仅在c DNA中扩增出条带,而同向引物能同时存在于c DNA和g DNA;且circ＿AFF1对RNase R消化和放线菌素D抑制基因转录的耐受性明显高于线性AFF1,证明circ＿AFF1是真实的circRNA。无论是否存在AngⅡ刺激,与circ-NC组相比,沉默circ＿AFF1组中HCAECs衰老相关蛋白的表达、SA-β-gal阳性细胞率及G0/G1期细胞比例下降,细胞培养液上清NO浓度、细胞内e NOS含量及SOD活性升高,提示沉默circ＿AFF1可抑制HCAECs衰老;而过表达circ＿AFF1组与其结果相反。双荧光素酶报告基因实验显示,与NC组相比,miR-106b-5p mimics与WT-circ＿AFF1共转染组荧光素酶活性明显下降;RIP实验显示,使用抗Ago2抗体处理后的IP组中,circ＿AFF1和miR-106b-5p丰度较Ig G组显著升高,证实circ＿AFF1与miR-106b-5p特异性结合。FISH实验显示在circ＿AFF1与miR-106b-5p在HCAECs胞质和胞核中均存在,但以胞质为主。同时,与circ-NC组相比,沉默circ＿AFF1组miR-106b-5p的表达水平升高,STAT3 m RNA的表达水平降低;而与空载质粒组相比,过表达circ＿AFF1组miR-106b-5p的表达水平降低,STAT3 m RNA的表达水平升高,提示circ＿AFF1对miR-106b-5p和STAT3具有调控作用。在miR-106b-5p与沉默circ＿AFF1共转染的回复实验,沉默miR-106b-5p可以部分逆转沉默circ＿AFF1对HCAECs应激性衰老的抑制作用,同时也逆转circ＿AFF1对STAT3的调控作用,提示circ＿AFF1靶向miR-106b-5p/STAT3参与对HCAECs应激性衰老的调控。结论1.AngⅡ可以诱导HCAECs发生应激性衰老并伴随STAT3的激活,沉默STAT3后可抑制AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老。2.Mi R-106b-5p与STAT3结合抑制其表达,同时STAT3可以部分逆转miR-106b-5p对AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老的抑制作用,表明miR-106b-5p靶向STAT3抑制AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老。3.Circ＿AFF1与miR-106b-5p结合,并抑制miR-106b-5p对STAT3的抑制作用,同时沉默miR-106b-5p可以部分逆转沉默circ＿AFF1对AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老的抑制作用,表明circ＿AFF1靶向miR-106b-5p/STAT3促进AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老。创新点及研究意义本实验验证了circ＿AFF1与AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老的关系,并进一步阐明了circ＿AFF1靶向miR-106b-5p/STAT3促进AngⅡ诱导HCAECs应激性衰老的机制。本实验从circRNA、miRNA与基因的调控角度,探索了circ＿AFF1对AngⅡ诱导HCAECs衰老的调控机制,揭示circRNA干预HCAECs衰老的新靶点,为防治衰老相关ASCVD提供了新的科学线索。