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目的:随着我国老龄人口的增加,老年痴呆发病人数日益增多,带来严重的医疗、社会和经济负担。慢性脑低灌注(CCH)是包括老年痴呆等神经退行性病变的重要诱因之一。尽管对CCH导致认知损伤发病机理研究的逐渐深入,目前临床对老年痴呆的预防和治疗缺乏有效的药物,需要寻找新的治疗思路和药物。CCH所致认知损伤的进展是多靶点的交互影响,研究针对单一靶点的治疗尚未收到令人满意的疗效。中医药复方具有多靶点干预、整体调节疾病病理的作用。因此,有必要研究具有治疗CCH相关认知功能障碍作用的神经保护类中药,探讨中药多靶点的干预作用,为痴呆的防治提供新思路。加减薯蓣丸临床应用于老年痴呆的治疗取得较好疗效,动物实验证实其具有改善CCH所致认知功能损伤的作用,因此本研究将进一步研究加减薯蓣丸的作用机理,探讨加减薯蓣丸对慢性脑低灌注模型大鼠阿尔茨海默样病理改变的作用,从该方对能量调节和应激信号介导的自噬角度探讨其对β淀粉样物质(Amyloid beta,Aβ)沉积的作用机制,并从对microRNA-132信号的调节角度探讨其对Tau蛋白磷酸化的作用机制。初步阐明加减薯蓣丸改善CCH所致阿尔茨海默样病理改变的机制,为中医药临床推广应用提供理论支持。方法:选取Wistar雄性大鼠60只随机分为4组,分别是正常组、模型组、西药组和中药组,每组15只。除正常组外,其余各组大鼠均进行双侧颈总动脉分次结扎并剪断(改良2VO法),制作慢性脑低灌注大鼠模型,造模后第7天开始灌胃。中药组每日灌胃给予加减薯蓣丸(10 g/kg);西药组每日灌胃给予尼莫地平(10 g/kg);模型组及正常组给予相同剂量生理盐水,各组连续给药4周。4周后行Morris水迷宫行为学检测,观察慢性脑低灌注大鼠学习记忆能力。行为学检测结束后,牺牲大鼠取全脑切片苏木素-伊红染色(HE)观察组织病理改变,尼氏染色(NISSL)观察神经元尼氏体水平,原位末端标记检测(TUNEL)神经元凋亡情况;取海马CA1区新鲜组织3mm~3,固定包埋制作超薄切片,铀铅双染色后透射电镜观察海马神经细胞内自噬小体形成;免疫组化检测LC3B、Aβ42、AMPK、p-AMPK、eIF2α、ATF4;qRT-PCR检测microRNA-132及eIF2α、ATF4、GSK-3βmRNA水平;Western blot检测eIF2α、ATF4、LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Tau、p-Tau、GSK-3β蛋白水平。结果:1.Morris水迷宫检测:在逃避潜伏期,第1天和第2天模型组与西药组和中药组所花时间无明显差异,到第3天西药组和中药组与模型组的逃避潜伏期出现明显差别(P<0.05),至第4天中药组、西药组和模型组的逃避潜伏期的时间均减少,西药组显示出最接近正常组的逃避潜伏时间。第5天进行水迷宫空间探索实验结果显示,四组大鼠的游泳速度无明显差异,正常组大鼠会在原平台区域来回游动穿梭或者停留,在平台区域停留时间比例增加,穿越平台次数多。与正常组相比,模型组大鼠的原平台停留时间及穿越次数明显减少(P<0.05),西药组和中药组大鼠经过药物干预后,原平台停留时间比例及穿越次数均较模型组有明显增加(P<0.05)。2.HE染色:正常组大鼠海马CA1区神经元结构完整、排列整齐、核染色清晰,而2VO后的模型组大鼠海马出现神经细胞数量减少、排列疏松、核固缩等神经病理性改变;在中药和西药干预后,海马组织病理结果有所改善,神经细胞数量增多、排列较为规则,提示加减薯蓣丸对CCH大鼠海马区神经元具有保护作用。3.NISSL染色:正常组大鼠海马神经细胞内含有较多的尼氏体,2VO慢性脑低灌注后模型组大鼠海马尼氏体数量减少,经中药及西药干预,尼氏体数量有所恢复。4.TUNEL染色:正常组海马CA1区TUNEL荧光染色神经细胞数量较少,提示凋亡神经元较少;模型组海马CA1区TUNEL荧光染色神经细胞数量明显增多,提示凋亡神经细胞数量增多;经药物干预4周后,西药组和中药组海马CA1区TUNEL染色减少。5.透射电镜:在正常组神经细胞中,未观察到形成自噬小体,模型组电镜下可见大量自噬小体,形态多样,包括可见正在包裹胞浆成分的自噬小体;中药组和西药组中也可以观察到自噬小体的出现。6.实时荧光定量PCR检测:CCH后大鼠海马CA1区ATF4、eIF2αmRNA表达水平显著升高(P<0.001);中药和西药干预后,ATF4、eIF2αmRNA表达水平降低;慢性脑低灌注后大鼠海马microRNA-132水平显著降低(P<0.001),GSK-3βmRNA水平显著升高(P<0.001);中药和西药干预后,microRNA-132水平升高(P<0.01),GSK-3βmRNA水平降低(P<0.01)。7.Western blot检测:AMPK、Tau蛋白表达无显著差异。与正常组相比,模型组经CCH后p-AMPK的蛋白表达显著增加(P<0.01),ATF4、eIF2α的蛋白表达显著增加(P<0.001),模型组LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值明显升高(P<0.01),GSK-3β和p-Tau(Ser396)蛋白水平升高,但不影响Tau蛋白的水平;中药和西药干预后,p-AMPK的蛋白水平降低,ATF4、eIF2α的蛋白水平降低,LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值降低,GSK-3β和p-Tau(Ser396)蛋白水平降低。8.免疫组化检测:与正常组相比,模型组经慢性低灌注诱导后p-AMPK表达显著升高(P<0.01),ATF4、eIF2α的蛋白表达显著升高(P<0.001),Aβ42沉积和LC3B均显著升高,可见神经炎性斑沉积;中药和西药干预后,p-AMPK降低,ATF4、eIF2α降低,Aβ42沉积和LC3B降低,中药组与西药组见无显著差异。结论:1.加减薯蓣丸调节能量应激介导的自噬,减少CCH大鼠海马Aβ沉积。2.加减薯蓣丸调节miR-132/GSK-3β信号,抑制CCH大鼠海马Tau磷酸化。