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目的噪声性听力损失(noise-induced hearing loss,NIHL)是最常见的职业病之一,氧化应激产生的高水平活性氧(氧自由基,reactive oxygen species,ROS)不仅是NIHL耳蜗毛细胞损伤的重要机制,也是多种感音性耳聋的基本病理基础。Prestin蛋白是耳蜗外毛细胞所特有的重要感音功能蛋白,是动物毛细胞电运动及耳蜗放大效应的分子基础。本研究通过探索氧化应激状态下ROS对毛细胞株HEI-OC1(House Ear Institute-Organ of Corti 1)Prestin表达的影响及氧化应激状态下Prestin基因的转录调控分子机制,为NIHL的防治提供理论依据。方法用含四种不同浓度(0μM、50μM、100μM、200μM)叔丁基过氧化氢(t-BHP)的培养基培养HEI-OC1细胞24 h或48 h,构建氧化应激损伤细胞模型;用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western Blot)测量氧化应激状态下HEI-OC1细胞Prestin在mRNA与蛋白质水平的表达量,观察氧化损伤对其表达的影响;reverse ChIP(反向染色质免疫共沉淀)与液相色谱-质谱联用(LC-MS)实验技术识别Prestin基因启动子区域结合蛋白,并从中筛选出具有转录调控作用的转录因子,根据各转录因子在氧化应激状态下mRNA的表达水平变化量,确定最重要的参与Prestin基因转录调控的转录因子并进行后续验证;染色质免疫沉淀联合定量PCR实验(ChIP-qPCR)被用来验证转录因子与Prestin基因是否可相互结合;针对转录因子设计3条siRNA(small interfering RNA)片段转染至HEI-OC1细胞内,筛选出干扰效果最好的siRNA片段,再对比转录因子沉默组与对照组Prestin的表达变化判断转录因子对Prestin基因的调控作用。结果氧化应激状态下HEI-OC1细胞Prestin蛋白表达量随t-BHP染毒浓度的增加而降低(24 h:F=201.541,P<0.05;48 h:F=151.169,P<0.05),而Prestin mRNA表达量出现上升(24 h:F=38.709,P<0.05;48 h:F=59.125,P<0.05),且相同浓度t-BHP染毒条件下培养时间较长时Prestin蛋白表达量较高。对未经任何处理的HEI-OC1细胞行reverse ChIP实验识别出与Prestin基因启动子区域相结合的蛋白共183种,其中具有转录调控作用的转录因子共8个。氧化应激损伤细胞模型检测这8种转录因子的mRNA表达情况,结果显示AP-2δmRNA表达量变化与Prestin mRNA表达变化间的相关性最强;ChIP-qPCR证明转录因子AP-2δ可与Prestin基因的转录起始位点-1441直接相结合,siRNA实验显示当HEI-OC1细胞AP-2δ被抑制时Prestin mRNA和Prestin蛋白表达量均明显升高(mRNA:t=-279.292,P<0.05;蛋白:t=-44.548,P<0.05),即转录因子AP-2δ对Prestin基因表现为负调控作用。氧化应激状态下AP-2δ在mRNA和蛋白质水平表达量均随t-BHP染毒浓度的增加而明显下降(P<0.05)。结论本研究发现氧化应激状态下HEI-OC1细胞Prestin蛋白由于被ROS破坏而表达量降低,Prestin mRNA表达量呈现反馈性的增加,转录因子AP-2δ是调控Prestin基因表达的重要转录因子,可与Prestin基因的启动子区域结合,且对Prestin基因表现为负调控作用,同时氧化应激状态下HEI-OC1细胞AP-2δ表达量降低。结果提示氧化应激状态下HEI-OC1细胞Prestin mRNA反馈性地表达增强以弥补蛋白水平的降低,即在氧化应激状态下Prestin呈代偿性机制表达,转录因子AP-2δ表达下调以减弱对其靶基因Prestin的抑制作用,进一步促进Prestin mRNA的表达以补偿性机制增加Prestin蛋白的表达水平维持细胞的正常功能。研究结果不仅丰富了Prestin的分子调控机制,而且也为NIHL的机制提供了新的观点,AP-2δ也可能成为修复NIHL耳蜗外毛细胞损伤的作用靶点。