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维生素B6(VB6)是机体正常生理活动所必须的重要营养素,吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)是 VB6 的 3 种基本形式,以及相应的磷酸酯型:磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)和磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP),其中PLP是其主要的活性形式,参加催化涉及氨基酸的各种代谢反应,在多种物质的合成和代谢过程中发挥着重要作用。自然界中,植物和微生物可以从头合成VB6以供自身生长发育需求,动物属于VB6异养生物主要从食物中获得VB6。研究发现植物性食物中VB6主要以PN的形式存在,因此食用性植物体内PN的含量与食品营养有密切关系。吡哆醛还原酶(Pyridoxal Reductase,PLR)是生物体内维生素B6代谢转换的作用酶,在NADPH存在的条件下,催化PL生成PN,因此,对植物PLR进行研究有助于进一步明确植物体内VB6的代谢转换,同时为通过基因水平提高植源性食物PN的含量强化食品VB6营养提供理论依据。本研究以云烟85为材料,以拟南芥吡哆醛还原酶氨基酸序列AtPLR1为模版,在公用数据库通过同源比对获得相似性达70%以上的数条烟草ESTs片段,同源拼接后采用互补脱氧核糖核酸(cDNA)的末端快速扩增-聚合酶链式反应(RACE-PCR)技术获得了烟草NtPLR1基因,序列分析表明,NtPLR1基因全长1370bp,编码369个氨基酸,预测编码蛋白的分子量为41070.5,理论等电点为9.42;具有Aldo-ket-red家族的保守结构域,氨基酸序列比对分析发现,NtPLR1与AtPLR1的序列相似性为79%。利用原核表达载体pET32a与目的基因连接构建重组载体并对NtPLR1基因进行原核表达及重组蛋白诱导,SDS-PAGE分析表达产物发现重组载体成功表达了包涵体形式的目的蛋白。采用实时荧光定量PCR对NtPLR1的组织表达差异性进行分析,结果表明,NtPLR1在烟草根、茎、叶片中均有表达,叶片中的表达量最高;进一步探索MPZA1逆境胁迫中的表达特性,本实验设置了紫外、氧化、NaCl、冷害及光照逆境胁迫环境,对NtPLR1在逆境胁迫下的表达模式进行分析,结果发现在紫外、氧化、盐害条件下随胁迫时间的延长,NtPLR1的表达呈先上升后下降的趋势,而在5℃冷害胁迫下,NtPLR1表达呈下降趋势,15℃及不同光照胁迫条件下NtPLR1的表达与对照比较没有显著差异;NtPLR1在逆境胁迫下的表达变化表明,NtPLR1与紫外、氧化及NaCl胁迫有应答反应。另外,在烟草的水培液中外源添加100mg/L的PL后,发现在PL的诱导下NtPLR1的表达呈上升趋势,在培养的第2、4、8天,NtPLR1的表达分别为对照的2.2、2.85、1.5倍,所对应的烟草叶片内PN积累量为对照的4.67、9.93、13.6倍。此外,利用植物表达载体2300成功构建了 NtPLR1基因过表达烟草,并获得转基因植株2棵。根据NtPLR1在逆境胁迫下的表达情况,结合PL诱导下表达量的变化情况,我们认为烟草NtPLR1与逆境胁迫有应答反应,并受PL的诱导。