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自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)是植物为了防止自交衰败、促进杂交优势,在长期进化过程中形成的一种复杂而完善的重要遗传机制,也是十字花科作物杂交制种中被广泛应用的重要性状,其柱头乳突细胞特异性排斥自花花粉接受异花花粉的反应,为研究植物胞间信号传导机理提供了一个理想的模式系统。甘蓝等芸薹属植物表现为典型的孢子体自交不亲和性,目前普遍认为,自花或相同单倍型花粉落到柱头上后,花粉中的S-位点半胱氨酸富集蛋白(S-locus cysteine-rich protein,SCR)和柱头中的S-位点受体激酶(S-locus receptor kinase,SRK)的胞外域以单倍型特异性的方式相互作用,使SRK构象改变释放原本结合在激酶结构域的类硫氧还蛋白1/2(Thioredoxin-h-like protein 1 and 2,THL1/THL2),并激发SRK激酶活性,使其与M-位点蛋白激酶(M-locus protein kinase,MLPK)相互作用,招募并磷酸化臂重复蛋白(Arm repeat containing 1,ARC1),ARC1结合并泛素化介导exocyst复合体亚基Exo70A1被蛋白酶体降解,继而经过级联反应实现自交不亲和反应。对于上述自交不亲和信号传导过程,至今仍有两个方面问题有待深入的研究。首先,对于MLPK参与信号传导的分子机制尚不明确,主要体现在SRK可以磷酸化MLPK,但是SRK与MLPK二者均可以磷酸化ARC1,且MLPK磷酸化ARC1的效应要比SRK强。因此在自交不亲和信号传导过程中ARC1被磷酸化这一过程是由MLPK单独招募并磷酸化,还是由SRK与MLPK一同完成该过程尚不明确。其次,对于SRK-ARC-Exo70A1这一信号传导通路也遭到疑问。在甘蓝型油菜和琴叶拟南芥中,反义抑制ARC1基因的表达,或者在甘蓝型油菜中过量表达Exo70A1,都只能部分打破材料的自交不亲和性,由此说明可能存在其他未知信号元件与ARC1一起共同参与下游信号传导。然而,先前通过SRK互作蛋白筛选和鉴定均未能成功分离除ARC1之外新的信号元件,因此,MLPK互作蛋白的分离与鉴定有望成为获取新信号元件的突破口。先前的研究表明可能存在其他的植物U-box蛋白(plant U-box protein,PUB)参与自交不亲和信号传导。基于MLPK蛋白功能域分析,我们课题组前期成功构建了MLPK诱饵蛋白表达载体,并利用酵母双杂交检测到MLPK与ARC1相互作用,课题组基于甘蓝PUB基因家族全基因组鉴定与表达分析,利用酵母双杂交初步筛选了三个可能与MLPK相互作用的候选甘蓝PUB蛋白,即BoPUB25、BoPUB43、BoPUB75。本研究在已有的研究基础上,首先克隆了三个候选PUB蛋白编码基因序列,进行了生物学分析,通过半定量RT-PCR分析三个候选PUB基因的组织表达模式;构建MLPK突变体,利用酵母双杂交和Bi FC技术明确了MLPK与三个候选PUB蛋白的相互作用关系,以期为探明MLPK在自交不亲和信号传导中的作用机制奠定基础。获得的主要研究结果如下:(1)BoPUB25、BoPUB43和BoPUB75蛋白编码基因克隆与生物信息学分析以高度自交不亲和性甘蓝‘A4’柱头c DNA为模版,采用PCR技术克隆了BoPUB25、BoPUB43、BoPUB75蛋白编码基因序列。生物信息学分析表明BoPUB25、BoPUB43和BoPUB75均为亲水蛋白,无跨膜结构,没有信号肽,均包含U-box和ARM保守功能域,属于PUB家族。亚细胞预测表明三者分别定位于线粒体、内质网和内质网。蛋白二级结构预测表示三者均以α螺旋为主,三级结构预测显示三者均包含调控钙离子运输的结构域。(2)MLPK序列分析与突变体的构建已有研究表明将MLPK蛋白序列的第112位赖氨酸突变为精氨酸或者第194位甘氨酸突变为精氨酸,均会使MLPK丧失自体磷酸化活性。本研究特异性扩增MLPK激酶结构域编码区序列,并通过PCR介导的点突变技术,分别将MLPK蛋白编码序列第112甘氨酸、194位赖氨酸突变为精氨酸,分别构建失活突变体mlpk1、mlpk2。测序结果表明MLPK基因编码序列以及突变体mlpk1,mlpk2突变位点与预期一致,突变体成功构建。(3)BoPUB25、BoPUB43和BoPUB75基因表达模式分析以高度自交不亲和性甘蓝‘A4’开花当天的柱头、花药、花瓣、萼片和叶片的c DNA为材料,以PP2A基因为内参基因,采用半定量RT-PCR技术分析了3个候选甘蓝PUB基因组织表达模式。结果显示BoPUB25、BoPUB43、BoPUB75和ARC1四个基因都在甘蓝柱头中表达,但不同于ARC1的是,BoPUB25、BoPUB43和BoPUB75基因在甘蓝五个组织中广泛表达。(4)酵母双杂交及Bi FC检测验证MLPK与三个候选甘蓝PUB蛋白相互作用利用酵母双杂交技术检测MLPK及其突变体与BoPUB25、BoPUB43及BoPUB75的相互作用,结果显示MLPK及其两个突变体与三个候选甘蓝PUB及ARC1间十二个组合的菌落都可以正常生长且变蓝,表明MLPK及其突变体可能分别与三个PUB蛋白及ARC1相互作用,尤其是失活突变体mlpk1和mlpk2可能与三个PUB蛋白以及ARC1相互作用,说明MLPK与三个PUB蛋白以及ARC1之间的相互作用可能并不完全依赖于MLPK的激酶活性。为了进一步验证酵母双杂交的检测结果,利用Bi FC技术检测MLPK及其突变体与BoPUB25、BoPUB43及BoPUB75之间的相互作用,结果显示MLPK及其突变体mlpk1、mlpk2与BoPUB25、BoPUB43、BoPUB75以及ARC1间十二种组合都观察到明显的荧光信号,且均定位在细胞膜。进一步证明了MLPK及其两个突变体与BoPUB25、BoPUB43、BoPUB75以及ARC1蛋白之间可能确实存在相互作用,且相互作用并不完全依赖于MLPK的激酶活性,MLPK与三个PUB间的相互作用均发生在细胞膜上。